Analyse des organspezifischen T-Zell-Rezeptor-Repertoires und seines Th1-, Th2-Profils in Zielorganen der GVHD nach Transplantation über Minor-Histokompatibilitätsantigen-Barrieren in einem Mausmodell:
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2006
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung Seite
1.1 Knochenmarktransplantation und Graft-versus-Host-Erkrankung 1
1.2 Minorhistokompatibilitätsantigene 4
1.3 Der T-Lymphozyt und sein T-Zell-Rezeptor 6
1.4 CDR3-Spectratyping 8
1.5 Kostimulatorische Moleküle 10
1.5.1 DasCD287CD80+(B7-l)/CD86+(B7-2)-System 11
1.5.2 Die Moleküle CD40/CD40L 12
1.5.3 Die Apoptose (Der programmierte Zelltod) 12
1.5.4 Der aktive Apoptoseweg über das CD95/CD95L/Caspasensystem 13
1.5.5 Der passive Apoptoseweg über das Bd-2/Bax-System 14
1.5.6 Die Moleküle PD1/PD1-L 14
1.5.7 Das Molekül CD83 15
1.6 DasZytokinmusterderCD4+Thl/Th2-Zellen 15
1.7 Ziel der Arbeit 17
2 Material
2.1 Allgemeines 18
2.2 Chemikalien und Reagenzien 18
2.3 Enzyme 19
2.4 Molekularbiologische Kits 20
2.5 Geräte 20
2.6 Laborzubehör 22
2.7 Kompetente E.coli-Stämme zur Klonierung 23
2.8 Primer 24
2.8.1 Allgemeines 24
2.8.2 Primer für die Identifizierung der T-Zell-Rezeptoren 24
I
Inhaltsverzeichnis
2.8.3 Primer für die Identifizierung der Effektormoleküle 26
2.8.4 Primer für die Identifzierung der Zytokine 27
2.9 Pufferlösungen 28
2.8.1 Laufpuffer für Elektrophoresen 28
2.8.2 Ladepuffer für Elektrophoresen 28
2.10 Längenstandard 29
3 Methoden
3.1 Grundlagen und Voraussetzungen für vorliegende Arbeit 30
3.2 Computerprogramme und Datenbanken 32
3.3 Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren 33
3.3.1 Agarosegele 33
3.3.2 Polyacrylamidgele 33
3.3.2.1 8% Polyacrylamidgele 33
3.3.2.2 8% Polyacrylamidgele 34
3.3.3 Gelelektrophorese 34
3.3.3.1 Agarosegele 34
3.3.3.2 8% Polyacrylamidgele für CDR3-Spectratyping 34
3.3.3.3 8% Polyacrylamidgele 35
3.3.4 Analyse der Elektrophoresegele 35
3.3.4.1 Analyse Ethidiumbromidgefärbter Agarosegele 35
3.3.4.2 Analyse der 8% Polyacrylamidgele 35
3.3.4.3 Analyse der 8% Polyacrylamidgele 36
3.4 Ethidiumbromidlösung 36
3.5 Verwendetes Material für die Bakterienkultur 36
3.5.1 Agarplatten 36
3.5.2 Nährmedium 37
3.6 Desoxynucleosidtriphosphatmischung 37
3.7 Diethylpyrocarbonat-H2O 37
II
Inhaltsverzeichnis
3.8 RNA-Isolation 37
3.9 cDNA-Synthese 38
3.10 CDR3-Spectratyping (PCR-Reakrionen) 39
3.10.1 Prinzip der Polymerasekettenreaktion 39
3.10.2 Prinzip der „nested PCR 39
3.10.3 PCR-Reaktion zur Amplifizierung von mVß8.1—»mCßnestll
(l.„nested -PCR) 41
3.10.4 PCR-Reaktion zur Amplifizierung von mVß8.1—»mjß
(2. ,,nested -PCR) 42
3.10.5 PCR-Reaktion zur Amplifizierung von mVß8.1—?mjß
mit unmarkiertem Primer 43
3.10.6 PCR zur Detektion von Effektormolekülen 44
3.11 Aufreinigung der DNA 45
3.12 Klonierung 46
3.13 Anzucht der E.coli-Bakterien 46
3.14 Anzucht, Analyse und Asuwahl von mit Bß/Jß cDNA
transfizierten Klonen 46
3.15 Plasmid-Isolation 48
3.16 Sequenzierung 48
4 Ergebnisse SO
4.1 Allgemeines 50
4.2 Ergebnisteil I: CDR3-Spectratypes mVß8.1-mCß 50
4.3 CDR3-Spectratypes mit mVß8.1 als forward-Primer und jeweils einem
der 12 möglichen mJß-Primern (mjßl.1-1.6; m)ß2.1-2.6) als
reverse-Primer an den Tagen 14 21 nach Transplantation 51
4.3.1 CDR3-Spectratypes mVß8.1-mJßl. 1-1.6, Tag 14 in Leber, Ileum,
Colon, Herz 53
4.3.2 CDR3-Spectratypes mVß8.1-mJß2.1-2.6, Tag 14 in Leber, Ileum,
III
Inhaltsverzeichnis
Colon, Herz 53
4.3.3 CDR3-Spectratypes mVß8.1-mJßl. 1-1.6, Tag 21 in Leber, Ueum,
Colon, Herz 54
4.3.4 CDR3-Spectratypes mVß8.1-mJß2.1-2.6, Tag 21 in Leber, Ileum,
Colon, Herz 54
4.4 Verwendung der mjßl- und mJß2-Segmente 55
4.5 CDR3-Sequenzen 55
4.5.1 Allgemeines 55
4.5.2 CDR3-Sequenzen aus T-Zellen der Orgaen Leber, Ileum, Colon,
Herz von Tag 14 nach Transplantation 57
4.5.3 CDR3-Sequenzen aus T-Zellen der Orgaen Leber, Ileum, Colon,
Herz von Tag 21 nach Transplantation 58
4.5.4 Konvergente CDR3-Sequenzen 59
4.5.5 Organbezogene Sequenzen 60
4.5.6 Konvergente CDR3-Motive 61
4.5.8 Identische CDR3-Sequenzen 61
4.5.9 Identische Motive in der CDR3-Sequenzen 65
4.6 Ladungsverhältnisse in identifizierten CDR3-Regionen 67
4.7 Ergebnisteil II: Das mRNA-Expressionsmuster kostimulatorischer
Moleküle sowie diverser weiterer Moleküle, die eine T-Zell-Antwort
beeinflussen sowie verschiedener Zytokine 69
4.7.1 Exemplarische Darstellung eines Polyacrylamidgels der PCR
zum Nachweis diverser Moleküle (hier die Moleküle Fas, FasL,
Bax, Bd-2, CD28, CD4, CD8 im Organ Herz des Tieres 271,
Tag 14 nach Transplantation 70
4.7.2 Darstellung der Mittelwertdiagramme diverser Moleküle 71
5 Diskussion
5.1 Teil I: Das T-Zell-Repertoire der intestinalen Organe und des
IV
Inhaltsverzeichnis
Herzens 78
5.2 Teil II: Expression diverser Moleküle und Zytokine 89
5.2.1 Allgemeines 89
5.2.2 Die Moleküle CD4+/CD8+ 90
5.2.3 Die Moleküle CD83/B7-1/B7-2 91
5.2.4 Die Moleküle CTLA-4/CD28 92
5.2.5 Die Moleküle CD40/CD40L 95
5.2.6 Die Moleküle PD1/PD1L 96
5.2.7 Die Apoptosemarker Fas/FasL; Bax/Bcl-2 99
5.2.8 Das Zytokinprofll in den Organen Herz und Ileum 103
5.2.9 Das Zytokin IL10 104
5.2.10 Das Zytokin IL-2 106
5.2.11 Das Zytokin TNF-a 107
5.2.12 Das Zytokin IFN-y 108
6 Zusammenfassung 111
7 Abkürzungsverzeichnis 113
8 Abbildungsverzeichnis 115
9 Literaturverzeichnis 118
10 Danksagung
11 Lebenslauf
V
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung Seite
1.1 Knochenmarktransplantation und Graft-versus-Host-Erkrankung 1
1.2 Minorhistokompatibilitätsantigene 4
1.3 Der T-Lymphozyt und sein T-Zell-Rezeptor 6
1.4 CDR3-Spectratyping 8
1.5 Kostimulatorische Moleküle 10
1.5.1 DasCD287CD80+(B7-l)/CD86+(B7-2)-System 11
1.5.2 Die Moleküle CD40/CD40L 12
1.5.3 Die Apoptose (Der programmierte Zelltod) 12
1.5.4 Der aktive Apoptoseweg über das CD95/CD95L/Caspasensystem 13
1.5.5 Der passive Apoptoseweg über das Bd-2/Bax-System 14
1.5.6 Die Moleküle PD1/PD1-L 14
1.5.7 Das Molekül CD83 15
1.6 DasZytokinmusterderCD4+Thl/Th2-Zellen 15
1.7 Ziel der Arbeit 17
2 Material
2.1 Allgemeines 18
2.2 Chemikalien und Reagenzien 18
2.3 Enzyme 19
2.4 Molekularbiologische Kits 20
2.5 Geräte 20
2.6 Laborzubehör 22
2.7 Kompetente E.coli-Stämme zur Klonierung 23
2.8 Primer 24
2.8.1 Allgemeines 24
2.8.2 Primer für die Identifizierung der T-Zell-Rezeptoren 24
I
Inhaltsverzeichnis
2.8.3 Primer für die Identifizierung der Effektormoleküle 26
2.8.4 Primer für die Identifzierung der Zytokine 27
2.9 Pufferlösungen 28
2.8.1 Laufpuffer für Elektrophoresen 28
2.8.2 Ladepuffer für Elektrophoresen 28
2.10 Längenstandard 29
3 Methoden
3.1 Grundlagen und Voraussetzungen für vorliegende Arbeit 30
3.2 Computerprogramme und Datenbanken 32
3.3 Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren 33
3.3.1 Agarosegele 33
3.3.2 Polyacrylamidgele 33
3.3.2.1 8% Polyacrylamidgele 33
3.3.2.2 8% Polyacrylamidgele 34
3.3.3 Gelelektrophorese 34
3.3.3.1 Agarosegele 34
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3.3.4 Analyse der Elektrophoresegele 35
3.3.4.1 Analyse Ethidiumbromidgefärbter Agarosegele 35
3.3.4.2 Analyse der 8% Polyacrylamidgele 35
3.3.4.3 Analyse der 8% Polyacrylamidgele 36
3.4 Ethidiumbromidlösung 36
3.5 Verwendetes Material für die Bakterienkultur 36
3.5.1 Agarplatten 36
3.5.2 Nährmedium 37
3.6 Desoxynucleosidtriphosphatmischung 37
3.7 Diethylpyrocarbonat-H2O 37
II
Inhaltsverzeichnis
3.8 RNA-Isolation 37
3.9 cDNA-Synthese 38
3.10 CDR3-Spectratyping (PCR-Reakrionen) 39
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3.10.2 Prinzip der „nested" PCR 39
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(2. ,,nested"-PCR) 42
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3.12 Klonierung 46
3.13 Anzucht der E.coli-Bakterien 46
3.14 Anzucht, Analyse und Asuwahl von mit Bß/Jß cDNA
transfizierten Klonen 46
3.15 Plasmid-Isolation 48
3.16 Sequenzierung 48
4 Ergebnisse SO
4.1 Allgemeines 50
4.2 Ergebnisteil I: CDR3-Spectratypes mVß8.1-mCß 50
4.3 CDR3-Spectratypes mit mVß8.1 als forward-Primer und jeweils einem
der 12 möglichen mJß-Primern (mjßl.1-1.6; m)ß2.1-2.6) als
reverse-Primer an den Tagen 14 21 nach Transplantation 51
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4.3.2 CDR3-Spectratypes mVß8.1-mJß2.1-2.6, Tag 14 in Leber, Ileum,
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Colon, Herz 53
4.3.3 CDR3-Spectratypes mVß8.1-mJßl. 1-1.6, Tag 21 in Leber, Ueum,
Colon, Herz 54
4.3.4 CDR3-Spectratypes mVß8.1-mJß2.1-2.6, Tag 21 in Leber, Ileum,
Colon, Herz 54
4.4 Verwendung der mjßl- und mJß2-Segmente 55
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Herz von Tag 14 nach Transplantation 57
4.5.3 CDR3-Sequenzen aus T-Zellen der Orgaen Leber, Ileum, Colon,
Herz von Tag 21 nach Transplantation 58
4.5.4 Konvergente CDR3-Sequenzen 59
4.5.5 Organbezogene Sequenzen 60
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4.5.8 Identische CDR3-Sequenzen 61
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4.6 Ladungsverhältnisse in identifizierten CDR3-Regionen 67
4.7 Ergebnisteil II: Das mRNA-Expressionsmuster kostimulatorischer
Moleküle sowie diverser weiterer Moleküle, die eine T-Zell-Antwort
beeinflussen sowie verschiedener Zytokine 69
4.7.1 Exemplarische Darstellung eines Polyacrylamidgels der PCR
zum Nachweis diverser Moleküle (hier die Moleküle Fas, FasL,
Bax, Bd-2, CD28, CD4, CD8 im Organ Herz des Tieres 271,
Tag 14 nach Transplantation 70
4.7.2 Darstellung der Mittelwertdiagramme diverser Moleküle 71
5 Diskussion
5.1 Teil I: Das T-Zell-Repertoire der intestinalen Organe und des
IV
Inhaltsverzeichnis
Herzens 78
5.2 Teil II: Expression diverser Moleküle und Zytokine 89
5.2.1 Allgemeines 89
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5.2.11 Das Zytokin TNF-a 107
5.2.12 Das Zytokin IFN-y 108
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11 Lebenslauf
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