Qualitative RNA-Bestimmung aus formalin-fixierten paraffin-eingebetteten Geweben:
Gespeichert in:
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Verl. Dr. Hut
2008
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Medizin
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| Beschreibung: | Zugl.: Gießen, Univ., Diss., 2007 |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 DiemRNA 1
1.1.1 Struktur und Aufgabe 1
1.2 Referenzgene 4
1.2.1 Wichtige Referenzgene 6
1.2.2 Ausgewählte Referenzgene 16
1.2.2.1 Poiphobilinogendeaminase(PBGD)-Gen 16
1.2.2.2 18S ribosomale RNA 17
1.3 Die Extraktion der Gesamt-RNA 18
1.4 Die Reverse Transkription 20
1.4.1 Auswahl der Primer zur cDNA-Synthese 20
1.4.2 Polymerasen der Reversen Transkription 21
1.4.3 Einflussfaktoren der RT-PCR 22
1.5 Die Polymerase-Ketten-Reaktion 23
1.5.1 Die Zyklen der PCR 23
1.5.2 Auswahl der Primer 23
1.5.3 Polymerasen 24
1.5.4 Einflussfaktoren der PCR 25
1.6 PCR-gestützte Nukleinsäurebestimmung bei Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten
Geweben (FFPEG) 27
2 Fragestellungen 29
3 Material und Methoden 30
3.1 Material 30
3.1.1 Präliminarien 30
3.1.2 Auswahl des Gewebes 32
3.1.3 Geräte 34
3.1.4 Reagenzien 36
3.1.4.1 Chemikalien 36
3.1.4.2 Spezielle Reagenzien für die Reverse Transkription 36
3.1.4.3 Enzyme und Primer für die Polymerase-Ketten-Reaktion 37
3.2 Methoden 37
3.2.1 Protokolle 37
3.2.1.1 Anmerkung 37
3.2.1.2 Verfahrensablauf 38
3.2.1.3 Allgemeine Maßnahmen 39
3.2.1.4 Hämatoxilin-Eosin Färbung 40
3.2.1.5 Extraktion der Gesamt-RNA bei ParaffinschnHIen 41
3.2.1.6 cONA-Synthese 43
3.2.1.7 PCR 44
3.2.1.8 PBGDund18SrRNA-Primer 44
3.2.1.9 Gelelektrophorese und Analyse der PCR-Pradukte 45
3.2.1.10 Dokumentation der PCR-Ergebnisse 46
3.2.2 Auswertungsbedingungen 47
3.2.2.1 Validitatskriterien der Ergebnisauswertung 60
3.2.3 Klassifizierung der untersuchten Fälle 51
3.2.4 Statistische Methoden 52
3.2.5 Datenspeicherung in einer Datenbank 53
4 Ergebnisse 54
4.1 RT-PCR Resultate 54
4.1.1 Darstellung der validen Ergebnisse 54
4.1.2 PBGD Säulendiagramme 56
4.1.2.1 Betrachtung der Fixierungsdauer 57
4.1.2.2 Betrachtung des Probenalters 59
4.1.3 18S Säulendiagramme 61
4.1.3.1 Betrachtung der Fixierungsdauer 61
4.1.3.2 Betrachtung des Probenalters 63
4.1.4 Proben mit sehr kurzer Fixierungsdauer 65
4.1.5 Häufigkeitsverteilung der Verfahrensschritte 65
4.1.5.1 Histogramme am Beispiel PBGD 65
5 Diskussion 69
5.1 Verfahrensbedingte Einflüsse auf die RNA-Integrität 69
5.1.1 Technische Probleme beim Umgang mitRNA 69
5.1.2 Extraktion 70
5.1.3 Proteinase-K-Digestion 72
5.1.4 Andere Aspekte der untersuchten Verfahren 73
5.1.4.1 Die Einbettungsmittel 73
5.1.4.2 DNase-Verdau 73
5.1.5 Ausgewählte Genfragmente 74
5.1.5.1 PBGD 75
5.1.5.2 18S 76
5.1.6 Variabilität der Genexpression 76
5.2 Fixierungsmittel 80
5.3 Das Untersuchungsmaterial 84
5.4 Die Präfixierungsdauer 86
5.5 Die Fixierungsdauer 89
5.6 Die Archivierungsdauer 92
5.7 Zusammenfassung und Ausblick 95
5.7.1 Summary - Zusammenfassung in englischer Sprache 96
6 Anhang 98
6.1 Formulare der Datenbank 98
6.2 Literaturverzeichnis 101
6.3 Glossar 108
6.4 Danksagung 116
|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 DiemRNA 1
1.1.1 Struktur und Aufgabe 1
1.2 Referenzgene 4
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1.2.2 Ausgewählte Referenzgene 16
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1.3 Die Extraktion der Gesamt-RNA 18
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1.6 PCR-gestützte Nukleinsäurebestimmung bei Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten
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3.2.2 Auswertungsbedingungen 47
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4.1 RT-PCR Resultate 54
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4.1.5.1 Histogramme am Beispiel PBGD 65
5 Diskussion 69
5.1 Verfahrensbedingte Einflüsse auf die RNA-Integrität 69
5.1.1 Technische Probleme beim Umgang mitRNA 69
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5.7 Zusammenfassung und Ausblick 95
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