Charakterisierung der humoralen Immunantwort nach Phagenidiotypvakzinierung im murinen BCL1-Lymphommodell:
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1. Biologie, Klinik und Therapie von Lymphomen 1
1.1.1. Non-HodgWn-Lymphome 1
1.1.2. Bisherige Therapie und neue Therapieansätze 2
1.2. Prinzipien immuntherapeutischer Verfahren bei der Tumortherapie 3
1.3. Vakzinierungsstrategien zur Lymphomtherapie 5
1.3.1. Der Idiotyp als Tumorantigen 5
1.3.2. Bisherige Ergebnisse der Idiotyp-Vakzinen 6
1.3.3. Schnellere Produktion durch gentechnisch hergestellte Idiotypvakzinen 7
1.4. Phagen-basierte Idiotypvakzinierung als neue Therapieoption 10
1.4.1. Phagen als Vektoren für die Idiotypvakzinierung 10
1.4.2. Bisherige Pilotstudien im murinen BCL1-Lymphommodell 12
1.4.3. Klinische Phase-I-Pilotstudie beim Multiplen MyeJom nach HDT 13
1.5. Zielsetzung der Arbeit 14
2. Matertal und Methoden 15
2.1. Ausgangsmaterialien 15
2.1.1. Chemikalien, Geräte und andere Materialien 15
2.1.2. Antikörper 17
2.1.3. Zelllinien 17
2.1.4. Phagen und Bakterien 18
2.1.5. Tiere 18
2.2. Tierversuche 18
2.2.1. Bestimmungen des Tierschutzgesetzes 18
2.2.2. Tierhaltung 18
2.2.3. Das murine BCL1-Lymphommodell 18
2.2.4. Studiendesign der Tierversuche 19
2.2.5. Invivo-KulturvonBCLI-Lymphomzellen 19
2.2.6. Versuchsgruppen 20
2.2.7. Anästhesieprotokoll zur Blutentnahme 21
2.2.8. Körperliche Untersuchung der Mäuse 21
2.2.9. Studienabbruchkriterien des Tierversuchs 21
2.3. Produktion von Phagenvakzinen 22
2.3.1. Herstellung von filamentösen fd-Phagen 22
2.3.2. Large Scale Phagemid Rescue zur Herstellung von rekombinanten BCL1g8
Phagenvakzinen 23
2.3.3. Herstellung der neuen Phagenidiotypvakzinfomiulierung 25
2.3.4. Aufreinigung von Phagen und Entfernung von Endotoxinen 26
2.3.5. Phagen-ELISA zur Titerbestimmung von Phagen 26
2.3.6. Quantifizierung von Phagen durch Proteinbestimmung (nach Bradfbrd) 27
2.3.7. Quantitativer Endotoxinnachweis mittels LAL-Methode 27
2.3.8. Kontrolle der Phagenpräparalion mittels Tricine-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. 28
2.4. Durchflusszytometrische Untersuchungen 30
2.5. ELISA(enzyme-linked-immunosorbent-assay) 31
2.5.1. Sandwichelisa 31
2.5.2. Präabsorpäonselisa 32
2.5.3. Zell-EUSA 32
2.6. Zellkultur 33
V
2.6.1. Kultivierung von Zelllinien 33
2.6.2. Bestimmung der Zellzahl 33
2.6.3. Einfrieren von Zellen 33
2.7. Aufreinigung von monoklonalen IgM-Antikörpern aus Hybridomen 34
2.7.1. Aufreinigung von Immunglobulinen Ober Protein A Säulen 34
2.7.2. Aufreinigung von Immunglobulinen über Gamma Bind Plus Sepharose 35
2.7.3. Quantitative Proteinbestimmung der aufgereinigten Antikörper mittels BCA 36
2.7.4. Analyse der aufgereinigten Antikörper mittels SDS-PAGE nach Laemmli 36
2.7.5. Coomassie-Blau Färbung von Polyacrylamidgelen 37
2.7.6. Silberfärbung von Polyacrylamidgelen 37
2.8. Statistische Analysen 38
3. Ergebnisse 39
3.1. Phagenidiotypvakzinierung und Tumorchallenge im BCL1-Lymphommodell 39
3.2. In-vivo Expansion von BCL1-Lymphomzellen 39
3.2.1. Durchflusszytometrische Untersuchungen von in-vivo expandierten BCU-Zellen 40
3.2.2. Untersuchung der Immunglobulinsubklassen auf expandierten BCL1-Lymphomzellen. .41
3.3. Überleben nach Vakzinierung mit BCL1-Idiotypvakzinen 42
3.4. Aufreinigung von BCU-lgM, BFF3-lgM und dem anti-BCL1 AK 42
3.4.1. Aufreinigung von 123F6 und BFF3 mittels Protein A Sepharose 43
3.4.2. Nachweis von anti-BCL1 Antikörpern im Überstand von MC106A5 43
3.4.3. Gamma Bind Plus Sepharose zur Aufreinigung von Ratten anti-BCL1 lgG2a 44
3.5. Analyse der Phagen-spezifischen humoralen Immunantwort nach
Phagenidiotypvakzinierung 46
3.5.1. Screening der Einzelseren auf Phagenantikörper 46
3.5.2. Optimierung der Vakzindosis 47
3.5.3. Charakterisierung der Phagenantikörper 49
3.5.4. Auswirkungen von GM-CSF auf die Phagen-spezifische Antikerperantwort 51
3.5.5. Vergleich der Immunogenität unterschiedlicher Idotypvakzinformulierungen 53
3.6. Analyse der anti-ldiotypischen Immunantwort nach Phagenidiotypvakzinierung 56
3.6.1. Entwicklung eines Zell-EUSAs zur Deteküon von antJ-BCL1 Serumantikörpem 56
3.6.2. Nachweis von an6-BCL1-spezifischen Antikörpern mittels ELISA 57
3.6.3. Untersuchung der Spezifflät von Anti-BCL1 Antikörpern 60
4. Diskussion 63
4.1. Durchführung der Tierversuche im murinen BCL1-Lymphommodell 63
4.2. Phagen als Vektoren für die Idiotypvakzinierung 65
4.3. Nachweis der humoralen Immunantwort gegen Phagen 66
4.3.1. Immunantwort gegen unterschiedliche Phagenvakzinformulierungen 66
4.3.2. Subtypenanalyse zur Unterscheidung einer möglichen Th1-bzw. Th2-Antwort 67
4.4. Tumorspezifische humorale Immunantwort nach Phagenidiotypvakzinierung 68
4.4.1. anti-BCU Antikörperantwort nach Vakzinierung mit rekombinanten BCL1-g8
Phagenvakzinen 68
4.4.2. anti-idiotypische humorale Immunantwort nach Vakzinierung mit neuer
Phagenidiotypvakzinfonnulierung 70
4.4.3. Vergleich der Phagenidiotypvakzinen mit dem Goldstandard BCL1-KLH 71
4.5. Bedeutung von GM-CSF als immunstimulatorisches Adjuvans 72
4.6. Vergleich der Phagenvakzinierung mit anderen Immunisierungsstrategien 73
5. Zusammenfassung und Ausblick 75
6. Literaturverzeichnis 76
7. Verzeichnis der Abkürzungen 88
VI
8. Danksagung 92
9. Lebenslauf 93
|
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IV
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1. Biologie, Klinik und Therapie von Lymphomen 1
1.1.1. Non-HodgWn-Lymphome 1
1.1.2. Bisherige Therapie und neue Therapieansätze 2
1.2. Prinzipien immuntherapeutischer Verfahren bei der Tumortherapie 3
1.3. Vakzinierungsstrategien zur Lymphomtherapie 5
1.3.1. Der Idiotyp als Tumorantigen 5
1.3.2. Bisherige Ergebnisse der Idiotyp-Vakzinen 6
1.3.3. Schnellere Produktion durch gentechnisch hergestellte Idiotypvakzinen 7
1.4. Phagen-basierte Idiotypvakzinierung als neue Therapieoption 10
1.4.1. Phagen als Vektoren für die Idiotypvakzinierung 10
1.4.2. Bisherige Pilotstudien im murinen BCL1-Lymphommodell 12
1.4.3. Klinische Phase-I-Pilotstudie beim Multiplen MyeJom nach HDT 13
1.5. Zielsetzung der Arbeit 14
2. Matertal und Methoden 15
2.1. Ausgangsmaterialien 15
2.1.1. Chemikalien, Geräte und andere Materialien 15
2.1.2. Antikörper 17
2.1.3. Zelllinien 17
2.1.4. Phagen und Bakterien 18
2.1.5. Tiere 18
2.2. Tierversuche 18
2.2.1. Bestimmungen des Tierschutzgesetzes 18
2.2.2. Tierhaltung 18
2.2.3. Das murine BCL1-Lymphommodell 18
2.2.4. Studiendesign der Tierversuche 19
2.2.5. Invivo-KulturvonBCLI-Lymphomzellen 19
2.2.6. Versuchsgruppen 20
2.2.7. Anästhesieprotokoll zur Blutentnahme 21
2.2.8. Körperliche Untersuchung der Mäuse 21
2.2.9. Studienabbruchkriterien des Tierversuchs 21
2.3. Produktion von Phagenvakzinen 22
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2.3.3. Herstellung der neuen Phagenidiotypvakzinfomiulierung 25
2.3.4. Aufreinigung von Phagen und Entfernung von Endotoxinen 26
2.3.5. Phagen-ELISA zur Titerbestimmung von Phagen 26
2.3.6. Quantifizierung von Phagen durch Proteinbestimmung (nach Bradfbrd) 27
2.3.7. Quantitativer Endotoxinnachweis mittels LAL-Methode 27
2.3.8. Kontrolle der Phagenpräparalion mittels Tricine-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. 28
2.4. Durchflusszytometrische Untersuchungen 30
2.5. ELISA(enzyme-linked-immunosorbent-assay) 31
2.5.1. Sandwichelisa 31
2.5.2. Präabsorpäonselisa 32
2.5.3. Zell-EUSA 32
2.6. Zellkultur 33
V
2.6.1. Kultivierung von Zelllinien 33
2.6.2. Bestimmung der Zellzahl 33
2.6.3. Einfrieren von Zellen 33
2.7. Aufreinigung von monoklonalen IgM-Antikörpern aus Hybridomen 34
2.7.1. Aufreinigung von Immunglobulinen Ober Protein A Säulen 34
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2.7.3. Quantitative Proteinbestimmung der aufgereinigten Antikörper mittels BCA 36
2.7.4. Analyse der aufgereinigten Antikörper mittels SDS-PAGE nach Laemmli 36
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2.7.6. Silberfärbung von Polyacrylamidgelen 37
2.8. Statistische Analysen 38
3. Ergebnisse 39
3.1. Phagenidiotypvakzinierung und Tumorchallenge im BCL1-Lymphommodell 39
3.2. In-vivo Expansion von BCL1-Lymphomzellen 39
3.2.1. Durchflusszytometrische Untersuchungen von in-vivo expandierten BCU-Zellen 40
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3.3. Überleben nach Vakzinierung mit BCL1-Idiotypvakzinen 42
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3.5. Analyse der Phagen-spezifischen humoralen Immunantwort nach
Phagenidiotypvakzinierung 46
3.5.1. Screening der Einzelseren auf Phagenantikörper 46
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3.6.1. Entwicklung eines Zell-EUSAs zur Deteküon von antJ-BCL1 Serumantikörpem 56
3.6.2. Nachweis von an6-BCL1-spezifischen Antikörpern mittels ELISA 57
3.6.3. Untersuchung der Spezifflät von Anti-BCL1 Antikörpern 60
4. Diskussion 63
4.1. Durchführung der Tierversuche im murinen BCL1-Lymphommodell 63
4.2. Phagen als Vektoren für die Idiotypvakzinierung 65
4.3. Nachweis der humoralen Immunantwort gegen Phagen 66
4.3.1. Immunantwort gegen unterschiedliche Phagenvakzinformulierungen 66
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4.4.3. Vergleich der Phagenidiotypvakzinen mit dem Goldstandard BCL1-KLH 71
4.5. Bedeutung von GM-CSF als immunstimulatorisches Adjuvans 72
4.6. Vergleich der Phagenvakzinierung mit anderen Immunisierungsstrategien 73
5. Zusammenfassung und Ausblick 75
6. Literaturverzeichnis 76
7. Verzeichnis der Abkürzungen 88
VI
8. Danksagung 92
9. Lebenslauf 93 |
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