CRH-R1/2-vermittelte Effekte von Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) auf die Monozytenfunktion und Monozyten-Endothel-Interaktion:
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2007
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adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 11
1.1 Pathogenese der Atherosklerose 11
1.2 Die Bedeutung der Adhäsionsmoleküle für die Monozyten-Endothel-
Interaktion 14
1.3 Mentaler Stress als kardiovaskulärer Risikofaktor 17
1.4 Chronische Hyperaktivität der HPA-Achse 19
1.5 CRH-Rezeptoren 19
1.6 Peripheres CRH 20
1.7 Periphere Effekte von CRH auf Endothel und Monozyt 21
2 Fragestellung und Zielsetzung 22
3 Material und Methoden 23
3.1 Materialien 23
3.1.1 Geräte und Software 23
3.1.2 Verbrauchsmaterial 23
3.1.3 Reagentien 26
3.2 Experimentell untersuchte Zellen 28
3.2.1 Humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1) 28
3.2.2 Humane monozytäre Zelllinie (THP-1) 28
3.2.3 Humane periphere Monozyten 29
3.3 Experimentell untersuchte Peptide und Stimulantien 29
3.3.1 Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) 29
3.3.2 Lipopolysaccharid (LPS) 31
7
3.4 Methoden 32
3.4.1 Zellkulturen 32
3.4.1.1 Zellkultur HMEC-1 32
3.4.1.2 Zellkultur THP-1 33
3.4.2 Gewinnung primärer Monozyten 33
3.4.2.1 Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation 33
3.4.2.2 Monozytenisolation mit MACS durch Negativselektion 34
3.4.2.3 Durchflusszytometrische Analyse der gewonnen Zellen (CD 14+) 34
3.4.3 CRH-Rezeptornachwets auf THP-1 Zellen 35
3.4.3.1 RT-PCR zum CRF-R1/2 Nachweis 35
3.4.3.2 Immunfluoreszenztechnik zum CRH-Rezeptomachweis 38
3.4.4 Intrazelluläre Fluoreszenzfärbung der Monozyten 40
3.4.5 Fluoreszenzmikroskopische Adhäsionsbestimmung 40
3.4.6 Fluoreszenzphotometrische Adhäsionsbestimmung 42
3.4.6.1 Fluorometrische Adhäsionsbestimmung von THP-1 an isoliert
stimulierten HMEC-1 42
3.4.6.2 Fluorometrische Adhäsionsbestimmung von THP-1 an HMEC-1 bei Ko-
Stimulation beider Zelltypen 45
3.4.7 Quantitative MAC-1/CD11b Bestimmung auf primären humanen
Monozyten 46
3.4.8 Durchflusszytometrie von ICAM-1/CD54 und VCAM-1/CD106 an
HMEC-1 47
3.4.9 Qualitätskontrollen 47
3.4.9.1 Mykoplasmendetektion auf RT-PCR Basis 47
3.4.9.2 Endotoxinnachweis 48
3.4.9.3 Proteinbestimmung 48
4 Ergebnisse 48
8
4.1 Zellkultur: Qualitätskontrollen 48
4.2 CRH-Rezeptor-Nachweis mittels RT-PCR auf THP-1 Zellen 49
4.3 CRH-Rezeptor-Nachweis mittels Immunfluoreszenz auf THP-1 Zellen 51
4.4 Entwicklung einer fluoreszenzphotometrischen Methode zur
Adhäsionsbestimmung 53
4.4.1 Fluoreszenzmikroskopische Adhäsionsbestimmung von THP-1 Zellen
an mit LPS stimulierten HMEC-1 54
4.4.2 Ermittlung der optimalen Versuchsbedingungen für eine fluoreszenz-
photometrische Adhäsionsbestimmung 56
4.4.3 Vergleich der Methoden am Beispiel LPS-stimulierter HMEC-1 und
THP-1 Zellen 57
4.4.4 Intra- und Interassay Kontrollen der fluorometrischen und
mikroskopischen Adhäsionsmeßmethode 59
4.5 Adhäsion von THP-1 an CRH-stimulierten HMEC-1 60
4.6 Adhäsion von THP-1 an HMEC-1 nach Ko-Stimulation beider
Zelltypen mit CRH 61
4.6.1 Statistische Auswertung der Daten 63
4.7 CRH-induzierte Mobilisierung von MAC-1/CD 11b auf primären
Monozyten 64
4.8 Einfluss von CRH auf die endotheliale Expression der
Adhäsionsmoleküle ICAM-1/CD54 und VCAM-1/CD106 65
5 Diskussion 66
5.1 Methodendiskussion 66
5.1.1 Diskussion der Zellkulturversuche 66
5.1.2 Diskussion der entwickelten Methode zur Adhäsionsbestimmung 67
5.1.2.1 Geschichte der bisherigen etablierten Adhäsionsverfahren 67
5.1.2.2 Etablierung eines eigenen Verfahrens zur Adhäsionsbestimmung 67
9
5.1.3 Diskussion der verwendeten Methoden zum CRH-Rezeptornachweis 70
5.1.3.1 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 70
5.1.3.2 CRH-Rezeptornachweis auf Proteinebene 71
5.1.4 Diskussion der verwendeten Methoden zur
Adhäsionsmoleküldetektion 73
5.1.4.1 Das monozytäre Adhäsionsmolekül MAC-1 73
5.1.4.2 Die endothelialen Adhäsionsmoleküle VCAM-1 und ICAM-1 75
5.1.4.3 Die verwendeten CRH-Konzentrationen 76
5.2 Diskussion der Ergebnisse hinsichtlich der Fragestellung 76
5.2.1 Werden auf der monozytären Zelllinie THP-1 CRH Rezeptoren
exprimiert? 76
5.2.2 Kann CRH die Adhäsion von Monozyten am Endothel beeinflussen
und, wenn ja, welche Mediatoren sind dabei beteiligt? 77
6 Zusammenfassung 78
7 Literaturverzeichnis 80
8 Legenden 93
8.1 Abbildungsverzeichnis 93
8.2 Tabellenverzeichnis 94
9 Danksagungen 95
10 Lebenslauf 97
10
8.1 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Response-to-Injury-Hypothese 14
Abb. 2: Schritte der Adhäsion und Transmigration 17
Abb. 3: Berechung der prozentualen monozytären Adhäsion am Endothel 44
Abb. 4: PCR-Elektrophorese für CRH-R1/2 auf THP-1 Zellen 49
Abb. 5: CRH-R1 Referenzsequenz NM_004382 versus Produktsequenz aus THP 50
Abb. 6: CRH-R2 Referenzsequenz NM_001883.2 versus Produktsequenz aus
THP 51
Abb. 7 a-c: Immunfluoreszenz-Nachweis von CRH-R1/2 auf primären Monozyten 53
Abb. 8: Adhärente THP-1 auf HMEC-1 Monolayer (Phasenkontrast) 54
Abb. 9 a,b: LPS induzierte Adhäsionszunahme der THP-1 an HMEC-1.
Fluoreszenzmikroskopisches Bild (100fach) in Doublelayer-Technik
(100fach). Solitär mit DAPI (blau) gefärbte Zellkern DNA und FITC
markiertes Zytoplasma der THP-1 Zellen 55
Abb. 11: Linearität der Fluoreszenz (mit THP-1 Zellen, n=5) 56
Abb. 12: Vergleich mikroskopische und fluorometrischen Adhäsionsbestimmung 58
Abb. 13: Zeitkinetik der Adhäsion von THP-1 an stimulierten HMEC-1 61
Abb. 14: Zeitkinetik der Kostimulation von THP-1 und HMEC-1. Mittelwerte und
Standardabweichung aus drei unabh. Versuchen mit je 4 Ansätzen pro
Zeit und Stimulanz. Signifikanzniveau p 0,01, Mann-Whitney-U-Test. 63
Abb. 15: MAC-1-Mobilisierung aus primären Monozyten durch CRH 64
93
8.2 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Intraassay-Kontrollen der mikroskopischen und fluorometrischen
Adhäsionsbestimmung 59
Tab. 2: Interassay-Kontrollen der mikroskopischen und fluorometrischen
Adhäsionsbestimmung 59
Tab. 3: Effekt von CRH und LPS auf endotheliales ICAM-1 und VCAM-1 65
94
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 11
1.1 Pathogenese der Atherosklerose 11
1.2 Die Bedeutung der Adhäsionsmoleküle für die Monozyten-Endothel-
Interaktion 14
1.3 Mentaler Stress als kardiovaskulärer Risikofaktor 17
1.4 Chronische Hyperaktivität der HPA-Achse 19
1.5 CRH-Rezeptoren 19
1.6 Peripheres CRH 20
1.7 Periphere Effekte von CRH auf Endothel und Monozyt 21
2 Fragestellung und Zielsetzung 22
3 Material und Methoden 23
3.1 Materialien 23
3.1.1 Geräte und Software 23
3.1.2 Verbrauchsmaterial 23
3.1.3 Reagentien 26
3.2 Experimentell untersuchte Zellen 28
3.2.1 Humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMEC-1) 28
3.2.2 Humane monozytäre Zelllinie (THP-1) 28
3.2.3 Humane periphere Monozyten 29
3.3 Experimentell untersuchte Peptide und Stimulantien 29
3.3.1 Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) 29
3.3.2 Lipopolysaccharid (LPS) 31
7
3.4 Methoden 32
3.4.1 Zellkulturen 32
3.4.1.1 Zellkultur HMEC-1 32
3.4.1.2 Zellkultur THP-1 33
3.4.2 Gewinnung primärer Monozyten 33
3.4.2.1 Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation 33
3.4.2.2 Monozytenisolation mit MACS durch Negativselektion 34
3.4.2.3 Durchflusszytometrische Analyse der gewonnen Zellen (CD 14+) 34
3.4.3 CRH-Rezeptornachwets auf THP-1 Zellen 35
3.4.3.1 RT-PCR zum CRF-R1/2 Nachweis 35
3.4.3.2 Immunfluoreszenztechnik zum CRH-Rezeptomachweis 38
3.4.4 Intrazelluläre Fluoreszenzfärbung der Monozyten 40
3.4.5 Fluoreszenzmikroskopische Adhäsionsbestimmung 40
3.4.6 Fluoreszenzphotometrische Adhäsionsbestimmung 42
3.4.6.1 Fluorometrische Adhäsionsbestimmung von THP-1 an isoliert
stimulierten HMEC-1 42
3.4.6.2 Fluorometrische Adhäsionsbestimmung von THP-1 an HMEC-1 bei Ko-
Stimulation beider Zelltypen 45
3.4.7 Quantitative MAC-1/CD11b Bestimmung auf primären humanen
Monozyten 46
3.4.8 Durchflusszytometrie von ICAM-1/CD54 und VCAM-1/CD106 an
HMEC-1 47
3.4.9 Qualitätskontrollen 47
3.4.9.1 Mykoplasmendetektion auf RT-PCR Basis 47
3.4.9.2 Endotoxinnachweis 48
3.4.9.3 Proteinbestimmung 48
4 Ergebnisse 48
8
4.1 Zellkultur: Qualitätskontrollen 48
4.2 CRH-Rezeptor-Nachweis mittels RT-PCR auf THP-1 Zellen 49
4.3 CRH-Rezeptor-Nachweis mittels Immunfluoreszenz auf THP-1 Zellen 51
4.4 Entwicklung einer fluoreszenzphotometrischen Methode zur
Adhäsionsbestimmung 53
4.4.1 Fluoreszenzmikroskopische Adhäsionsbestimmung von THP-1 Zellen
an mit LPS stimulierten HMEC-1 54
4.4.2 Ermittlung der optimalen Versuchsbedingungen für eine fluoreszenz-
photometrische Adhäsionsbestimmung 56
4.4.3 Vergleich der Methoden am Beispiel LPS-stimulierter HMEC-1 und
THP-1 Zellen 57
4.4.4 Intra- und Interassay Kontrollen der fluorometrischen und
mikroskopischen Adhäsionsmeßmethode 59
4.5 Adhäsion von THP-1 an CRH-stimulierten HMEC-1 60
4.6 Adhäsion von THP-1 an HMEC-1 nach Ko-Stimulation beider
Zelltypen mit CRH 61
4.6.1 Statistische Auswertung der Daten 63
4.7 CRH-induzierte Mobilisierung von MAC-1/CD 11b auf primären
Monozyten 64
4.8 Einfluss von CRH auf die endotheliale Expression der
Adhäsionsmoleküle ICAM-1/CD54 und VCAM-1/CD106 65
5 Diskussion 66
5.1 Methodendiskussion 66
5.1.1 Diskussion der Zellkulturversuche 66
5.1.2 Diskussion der entwickelten Methode zur Adhäsionsbestimmung 67
5.1.2.1 Geschichte der bisherigen etablierten Adhäsionsverfahren 67
5.1.2.2 Etablierung eines eigenen Verfahrens zur Adhäsionsbestimmung 67
9
5.1.3 Diskussion der verwendeten Methoden zum CRH-Rezeptornachweis 70
5.1.3.1 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 70
5.1.3.2 CRH-Rezeptornachweis auf Proteinebene 71
5.1.4 Diskussion der verwendeten Methoden zur
Adhäsionsmoleküldetektion 73
5.1.4.1 Das monozytäre Adhäsionsmolekül MAC-1 73
5.1.4.2 Die endothelialen Adhäsionsmoleküle VCAM-1 und ICAM-1 75
5.1.4.3 Die verwendeten CRH-Konzentrationen 76
5.2 Diskussion der Ergebnisse hinsichtlich der Fragestellung 76
5.2.1 Werden auf der monozytären Zelllinie THP-1 CRH Rezeptoren
exprimiert? 76
5.2.2 Kann CRH die Adhäsion von Monozyten am Endothel beeinflussen
und, wenn ja, welche Mediatoren sind dabei beteiligt? 77
6 Zusammenfassung 78
7 Literaturverzeichnis 80
8 Legenden 93
8.1 Abbildungsverzeichnis 93
8.2 Tabellenverzeichnis 94
9 Danksagungen 95
10 Lebenslauf 97
10
8.1 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Response-to-Injury-Hypothese 14
Abb. 2: Schritte der Adhäsion und Transmigration 17
Abb. 3: Berechung der prozentualen monozytären Adhäsion am Endothel 44
Abb. 4: PCR-Elektrophorese für CRH-R1/2 auf THP-1 Zellen 49
Abb. 5: CRH-R1 Referenzsequenz NM_004382 versus Produktsequenz aus THP 50
Abb. 6: CRH-R2 Referenzsequenz NM_001883.2 versus Produktsequenz aus
THP 51
Abb. 7 a-c: Immunfluoreszenz-Nachweis von CRH-R1/2 auf primären Monozyten 53
Abb. 8: Adhärente THP-1 auf HMEC-1 Monolayer (Phasenkontrast) 54
Abb. 9 a,b: LPS induzierte Adhäsionszunahme der THP-1 an HMEC-1.
Fluoreszenzmikroskopisches Bild (100fach) in Doublelayer-Technik
(100fach). Solitär mit DAPI (blau) gefärbte Zellkern DNA und FITC
markiertes Zytoplasma der THP-1 Zellen 55
Abb. 11: Linearität der Fluoreszenz (mit THP-1 Zellen, n=5) 56
Abb. 12: Vergleich mikroskopische und fluorometrischen Adhäsionsbestimmung 58
Abb. 13: Zeitkinetik der Adhäsion von THP-1 an stimulierten HMEC-1 61
Abb. 14: Zeitkinetik der Kostimulation von THP-1 und HMEC-1. Mittelwerte und
Standardabweichung aus drei unabh. Versuchen mit je 4 Ansätzen pro
Zeit und Stimulanz. Signifikanzniveau p 0,01, Mann-Whitney-U-Test. 63
Abb. 15: MAC-1-Mobilisierung aus primären Monozyten durch CRH 64
93
8.2 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Intraassay-Kontrollen der mikroskopischen und fluorometrischen
Adhäsionsbestimmung 59
Tab. 2: Interassay-Kontrollen der mikroskopischen und fluorometrischen
Adhäsionsbestimmung 59
Tab. 3: Effekt von CRH und LPS auf endotheliales ICAM-1 und VCAM-1 65
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