Inaktivierung der Aminopeptidasen des endoplasmatischen Retikulums ERAP-1 und ERAP-2 mittels somatischer Rekombination und RNS-Interferenz:
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
A. Einleitung. Seite 9
I. Antigenpräsentation der Zelle Seite 9
1) Allgemeiner Überblick Seite 9
2) Antigenprozessierungfiir MHC Klasse I. Seile 12
3) ERAP-1 undERAP-2 Seite 15
4) Ziel der Arbeit Seite 18
II. Allgemeine Knock out Strategie Seite 19
III. Überprüfen des Erfolgs der homologen Rekombination Seite 22
IV. Zellulärer „Knock down mit Hilfe der RNS-Interferenz Seite 24
V. Auswirkungen der Inaktivierung von ERAP-1 und ERAP-2
durch RNSi Seite 26
VI. Wahl der Zelllinien Seite 27
B. Material und Methoden. Seite 29
I. Liste verwendeter Reaktive und Puffer Seite 29
II. Allgemein verwendete Techniken Seite 39
1) Western Biot Seite 39
la) Western BlotßrERAP-l/ERAP-2 Seite 39
2)RTPCR Seite 40
2a) RTPCRßr ERAP-l/ERAP-2 Seite 41
3)FACS. Seite 43
III. Modifikation des Klonierungsvektors Seite 44
IV. Amplifikation per PCR Seite 44
V. Klonierung in den Transitvektor pCRBlunt und Sequenzierung ...Seite 48
VI. Klonierung der KO-Plasmide Seite 49
VII. Präliminäre Versuche Seite 50
1) Nachweis der Expression von ERAP-1 und ERAP-2
inHCTllö-Zellen Seite 50
2) Überprüfung der Antibiotikaresistenz und der
Transfektionseffizienz von HCT116-Zellen Seite 51
VIII. Transfektion der KO Plasmide und Zellkultur Seite 52
IX. Überprüfen der Zellklone Seite 53
7
X. RNSi-Duplexe Seite 55
XL Transfektion der siRNS und Kulturbedingungen Seite 56
XII. Nachweis der RNS-Interferenz Seite 58
XIII. Proteinbestimmung Seite 58
XIV. Western Blot gegen MHC Klasse I Seite 59
XV. Auswirkung der Inaktivierung von ERAP-l/ERAP-2 Seite 59
C. Ergebnisse. Seite 61
I. Klonierung in den Transitvektor pCRBlunt und Sequenzierung Seite 61
II. Klonierung der KO Plasmide Seite 61
III. Präliminäre Versuche Seite 63
1) Nachweis der Expression von ERAP-l/ERAP-2
inHCTllö-Zellen Seile 63
2) Überprüfiing der Antibiotikaresistenz und der
Transfektionseffizienz von HCT116-Zellen Seite 66
IV. Überprüfen des Erfolgs der homologen Rekombination Seite 68
V. Inaktivierung von GFP zur Kontrolle des RNSi-Protokolls Seite 70
VI. Inaktivierung von ERAP-1 und ERAP-2 durch RNSi Seite 72
VII. Western Blot gegen MHC Klasse I Seite 77
VIII. Auswirkungen der Inaktivierung von ERAP-1 und ERAP-2 Seite 78
D. Diskussion. Seite 89
E. Zusammenfassung. .. . . ..... . Seite 102
F. Literaturverzeichnis. Seite 103
G. Lebenslauf. Seite 108
8
|
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INHALTSVERZEICHNIS
A. Einleitung. Seite 9
I. Antigenpräsentation der Zelle Seite 9
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V. Auswirkungen der Inaktivierung von ERAP-1 und ERAP-2
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B. Material und Methoden. Seite 29
I. Liste verwendeter Reaktive und Puffer Seite 29
II. Allgemein verwendete Techniken Seite 39
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VII. Präliminäre Versuche Seite 50
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2) Überprüfung der Antibiotikaresistenz und der
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X. RNSi-Duplexe Seite 55
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2) Überprüfiing der Antibiotikaresistenz und der
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