Analyse der transkriptionellen Regulation des humanen neuronalen NO-Synthase Gens:
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2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
2. Zielsetzung der Arbeit 7
3. Material und Methoden 8
3.1. Allgemeine Substanzen 8
3.2. Isolation, Reinigung und Quantifizierung von Desoxyribonucleinsäuren
(DNA) 8
3.2.1. Ethanolpräzipitation 8
3.2.2. Isolierung von Plasmid DNA 8
3.2.3. Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA 9
3.3. Auftrennung und Isolierung von DNA-Fragmenten 10
3.3.1. Analytische Agarosegel-Elektrophorese 11
3.3.2. Isolierung von DNA-Fragmenten mittels präparativer Agarosegel-
Elektrophorese und Gelelution 11
3.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 12
3.4.1. Primer-Design und Herstellung 13
3.4.2. PCR-Ansatz 13
3.4.3. „Bakterienkolonie-PCR zur Charakterisierung von transformierten
Bakterienklonen 16
3.5. Enzymatische Veränderung von DNA 16
3.5.1. Restriktionsendonukleasen 16
3.5.2. Dephosphorylierung mittels alkalischer Phosphatase 18
3.5.3. T4-DNA-Ligase 18
3.5.4. Glätten von 3 - oder 5 -überhängenden DNA Enden mittels End
Conversion Mix 19
3.5.5. Erzeugung eines 3 Adenin-Überhangs mittels A-tailing 19
3.6. Bakterien 20
3.6.1. Nährmedien und Antibiotika 20
3.6.2. Kultivierung der Bakterien 20
3.7. Verwendete Plasmide 21
3.7.1. pGL3-basic (Promega) 21
3.7.2. pRL-TK (Promega) 21
3.7.3. pCR-XL-TOPO Vektor (Invitrogen) 22
3.8. Transformation von kompetenten E. coli Bakterien 22
3.9. Sequenzierung und Auswertung der Sequenzdaten 23
3.10. Klonierung von Plasmiden, DNA Fragmenten und PCR-Produkten 23
3.10.1. TA-Klonierung 24
i
3.10.2. Blunt end Klonierung 24
3.10.3. Sticky end Klonierung 24
3.10.4. Klonierung der Reportergen-Plasmide 24
3.10.4.1. Klonierung von pNOSexli-5 8 und pNOSexli-5 7 25
3.10.4.2. Klonierung von pl IOSexli-5 6 28
3.10.4.3. Klonierung von pNOSexli-5 5, pNOSexli-5 3,
pNOSexli-3 1, pNOSexli-3 2 und pNOSexli-3 3 29
3.10.4.4. Klonierung von pNOSex2-l und pNOSex2-2 30
3.11. Transfektionsexperimente 32
3.11.1. Zellkultur 32
3.11.1.1. Allgemeines Material und Geräte für die Zellkultur 32
3.11.1.2. Verwendete Zelllinien und allgemeine Kulturbedingungen
33
3.11.1.3. Herstellung von Dauerkulturen 34
3.12. Transiente Transfektionen 34
3.12.1. Transiente Transfektion von TGW-nu-I Zellen mittels Lipofectamin
und passive Lyse der Zellen 34
3.12.2. Transiente Transfektion von ME-180 Zellen mittels Effectene und
passive Lyse der Zellen 36
3.12.3. Retinolsäurestimulation transient transfizierter TGW-nu-I Zellen..37
3.13. Luciferasemessung 37
3.14. Retinolsäurestimulation von TGW-nu-I Zellen über 7 Tage 38
3.15. Proteinextraktion und Proteinkonzentrations- bestimmung 39
3.15.1. Ernte der TGW-nu-I Zellen zur Protein- extraktion 39
3.15.2. Lyse der TGW-nu-I Zellen zur Proteinextraktion 39
3.15.3. Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford und Vorbereitung
der Proben für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) 39
3.16. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und Western Blot Analyse 40
3.16.1. SDS-PAGE 40
3.16.2. Western Blot 42
3.16.3. Immunologische Detektion der zu untersuchenden Proteine 42
3.17. Auswertung und Statistik 43
4. Ergebnisse 44
4.1. Ergebnisse der Analyse des Exon lf-as Multipromotorkomplexes des
humanen nNOS Gens 44
4.1.1. Charakterisierung der 5 -regulatorischen Region von Exon lf 46
4.1.2. Charakterisierung der 5 -regulatorischen Region von Exon lg 47
4.1.3. Charakterisierung der 5 -regulatorischen Region von Exon lh 49
ii
4.1.4. Charakterisierung der 3 -regulatorischen Region des
Multipromotorkomplexes von Exon lf-as 50
4.1.5. Charakterisierung der 5 -regulatorischen Region von Exon li 52
4.2. Retinolsäure stimuliert die nNOS-Proteinexpression in TGW-nu-I Zellen 54
4.3. Einfluss von Retinolsäure auf die Aktivität des nNOS Exon lf-i/as
Multipromotorkomplexes in transient transfizierten TGW-nu-I Zellen 55
5. Diskussion 57
5.1. Alternative Promotoren regulieren die Transkription von Exon lf, lg, lh und
1 i/as 58
5.2. Regulation der nNOS Expression durch Retinolsäure 61
6. Zusammenfassung 63
7. Literaturverzeichnis 65
8. Abkürzungsverzeichnis 77
9. Abbildungsverzeichnis 79
10. Tabellenverzeichnis 80
11. Anhang 81
11.1. Verwendete Primer 81
11.2. Nukleotidsequenz der 5 - und 3 -flankierenden Region der humanen nNOS
Exons lf, lg, lh und li/as 82
11.3. Nukleotidsequenz der 5 - und 3 -flankierenden Region des humanen nNOS
Exons 2 87
12. Danksagung 89
13. Lebenslauf 90
iii
|
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
2. Zielsetzung der Arbeit 7
3. Material und Methoden 8
3.1. Allgemeine Substanzen 8
3.2. Isolation, Reinigung und Quantifizierung von Desoxyribonucleinsäuren
(DNA) 8
3.2.1. Ethanolpräzipitation 8
3.2.2. Isolierung von Plasmid DNA 8
3.2.3. Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA 9
3.3. Auftrennung und Isolierung von DNA-Fragmenten 10
3.3.1. Analytische Agarosegel-Elektrophorese 11
3.3.2. Isolierung von DNA-Fragmenten mittels präparativer Agarosegel-
Elektrophorese und Gelelution 11
3.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 12
3.4.1. Primer-Design und Herstellung 13
3.4.2. PCR-Ansatz 13
3.4.3. „Bakterienkolonie-PCR" zur Charakterisierung von transformierten
Bakterienklonen 16
3.5. Enzymatische Veränderung von DNA 16
3.5.1. Restriktionsendonukleasen 16
3.5.2. Dephosphorylierung mittels alkalischer Phosphatase 18
3.5.3. T4-DNA-Ligase 18
3.5.4. Glätten von 3'- oder 5'-überhängenden DNA Enden mittels End
Conversion Mix 19
3.5.5. Erzeugung eines 3'Adenin-Überhangs mittels A-tailing 19
3.6. Bakterien 20
3.6.1. Nährmedien und Antibiotika 20
3.6.2. Kultivierung der Bakterien 20
3.7. Verwendete Plasmide 21
3.7.1. pGL3-basic (Promega) 21
3.7.2. pRL-TK (Promega) 21
3.7.3. pCR-XL-TOPO Vektor (Invitrogen) 22
3.8. Transformation von kompetenten E. coli Bakterien 22
3.9. Sequenzierung und Auswertung der Sequenzdaten 23
3.10. Klonierung von Plasmiden, DNA Fragmenten und PCR-Produkten 23
3.10.1. TA-Klonierung 24
i
3.10.2. Blunt end Klonierung 24
3.10.3. Sticky end Klonierung 24
3.10.4. Klonierung der Reportergen-Plasmide 24
3.10.4.1. Klonierung von pNOSexli-5'8 und pNOSexli-5'7 25
3.10.4.2. Klonierung von pl\IOSexli-5'6 28
3.10.4.3. Klonierung von pNOSexli-5'5, pNOSexli-5' 3,
pNOSexli-3'1, pNOSexli-3'2 und pNOSexli-3'3 29
3.10.4.4. Klonierung von pNOSex2-l und pNOSex2-2 30
3.11. Transfektionsexperimente 32
3.11.1. Zellkultur 32
3.11.1.1. Allgemeines Material und Geräte für die Zellkultur 32
3.11.1.2. Verwendete Zelllinien und allgemeine Kulturbedingungen
33
3.11.1.3. Herstellung von Dauerkulturen 34
3.12. Transiente Transfektionen 34
3.12.1. Transiente Transfektion von TGW-nu-I Zellen mittels Lipofectamin
und passive Lyse der Zellen 34
3.12.2. Transiente Transfektion von ME-180 Zellen mittels Effectene und
passive Lyse der Zellen 36
3.12.3. Retinolsäurestimulation transient transfizierter TGW-nu-I Zellen.37
3.13. Luciferasemessung 37
3.14. Retinolsäurestimulation von TGW-nu-I Zellen über 7 Tage 38
3.15. Proteinextraktion und Proteinkonzentrations- bestimmung 39
3.15.1. Ernte der TGW-nu-I Zellen zur Protein- extraktion 39
3.15.2. Lyse der TGW-nu-I Zellen zur Proteinextraktion 39
3.15.3. Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford und Vorbereitung
der Proben für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) 39
3.16. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und Western Blot Analyse 40
3.16.1. SDS-PAGE 40
3.16.2. Western Blot 42
3.16.3. Immunologische Detektion der zu untersuchenden Proteine 42
3.17. Auswertung und Statistik 43
4. Ergebnisse 44
4.1. Ergebnisse der Analyse des Exon lf-as Multipromotorkomplexes des
humanen nNOS Gens 44
4.1.1. Charakterisierung der 5'-regulatorischen Region von Exon lf 46
4.1.2. Charakterisierung der 5'-regulatorischen Region von Exon lg 47
4.1.3. Charakterisierung der 5'-regulatorischen Region von Exon lh 49
ii
4.1.4. Charakterisierung der 3'-regulatorischen Region des
Multipromotorkomplexes von Exon lf-as 50
4.1.5. Charakterisierung der 5'-regulatorischen Region von Exon li 52
4.2. Retinolsäure stimuliert die nNOS-Proteinexpression in TGW-nu-I Zellen 54
4.3. Einfluss von Retinolsäure auf die Aktivität des nNOS Exon lf-i/as
Multipromotorkomplexes in transient transfizierten TGW-nu-I Zellen 55
5. Diskussion 57
5.1. Alternative Promotoren regulieren die Transkription von Exon lf, lg, lh und
1 i/as 58
5.2. Regulation der nNOS Expression durch Retinolsäure 61
6. Zusammenfassung 63
7. Literaturverzeichnis 65
8. Abkürzungsverzeichnis 77
9. Abbildungsverzeichnis 79
10. Tabellenverzeichnis 80
11. Anhang 81
11.1. Verwendete Primer 81
11.2. Nukleotidsequenz der 5'- und 3'-flankierenden Region der humanen nNOS
Exons lf, lg, lh und li/as 82
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Exons 2 87
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