Identifizierung neuer Interaktionspartner des humanen Septins SEPT8v̲2:
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2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Die Septine 1
1.2 Nomenklatur der Septine 2
1.3 Struktur der Septine 4
1.4 Das humane Septin 8 7
1.5 Septinkomplexe 9
1.6 Funktion der Septine 10
1.6.1 Zytokinese 10
1.6.2 Zellorganisation 11
1.6.3 Exozytose 11
1.7 Beteiligung der Septine an pathologischen Prozessen 13
1.7.1 Neoplasien 13
1.7.2 Neurodegenerative Erkrankungen 14
1.8 Das Yeast Two - Hybrid System 15
1.9 Zielsetzung der Arbeit 18
2 MATERIAL UND METHODEN 19
2.1 Material 19
2.1.1 Hefestämme 19
2.1.2 Bakterienstamm 19
2.1.3 Expressionsvektoren 20
2.2 Mikrobiologische Methoden 22
2.2.1 Arbeiten mit Saccharomyces cerevisiae 22
2.2.1.1 Übernacht - Kulturen 22
2.2.1.2 Bestimmung der optischen Dichte 22
2.2.1.3 Aufbewahrung 22
I
Inhaltsverzeichnis
2.2.1.4 Kultivierung auf Agarplatten 23
2.2.2 Arbeiten mit E. coli 23
2.2.2.1 Kultivierung 23
2.2.2.2 Herstellung elektrokompetenter Bakterien 23
2.3 Molekularbiologische Methoden 24
2.3.1 Transfektion 24
2.3.1.1 Transfektion von Hefe 24
2.3.1.2 Cotransfektion von Hefe 25
2.3.1.3 Transfektion von E. coli 26
2.3.2 Isolierung von Plasmid- DNA 26
2.3.2.1 Alkalische Lyse von Bakterien 27
2.3.2.2 Midi - Prep - Kit 28
2.3.2.3 Hefeplasmidisolierung 28
2.3.3 Konzentrationsbestimmung von DNA 29
2.3.4 Restriktionsverdau von DNA 29
2.3.5 Gelelektrophorese von DNA 29
2.3.6 DNA - Sequenzierung 30
2.3.7 Fällung von DNA 31
2.3.7.1 Alkohol - Fällung 31
2.3.7.2 PEG-Fällung 32
2.4 Proteinbiochemische Methoden 33
2.4.1 Isolierung von Hefelysat 33
2.4.2 Isolierung von Proteinen aus Hefezellen 33
2.4.3 SDS - Polyacrylamid - Gelelektrophorese 34
2.4.3.1 Coomassie Blue - Färbung 35
2.4.3.2 Westernblot 35
2.4.3.2.1 Ponceau S Färbung 36
2.4.3.2.2 Immundetektion 36
II
Inhaltsverzeichnis
2.5 Das Yeast Two - Hybrid System 37
2.5.1 Kreuzung von S. cerevisiae 38
2.5.2 Testung des Bait - Proteins auf autonome Aktivierung der Reportergene 39
2.5.3 Kontrollmating 40
2.5.4 Bestimmung des Titers der cDNA - Library 41
2.5.5 Bestimmung der Matingeffizienz 41
2.5.6 Bestimmung der Anzahl der gescreenten Klone 42
2.5.7 Selektion nach einer positiven Yeast Two - Hybrid Interaktion 42
3 ERGEBNISSE 44
3.1 Vektorkonstrukte 44
3.1.1 DNA - BD Vektor Konstrukte 44
3.1.2 DNA - AD Vektor Konstrukte 44
3.2 Untersuchung auf Eignung der Bait - Proteine für das
Yeast Two - Hybrid System 45
3.3 Kontrolle der Matingeffizienz 47
3.4 Nachweis der Expression der Fusionsproteine in transformierten Hefen 48
3.5 Analyse des Yeast Two - Hybrid Screens der humanen
Gehirn-und Herz cDNA - Bank 51
3.5.1 Berechnungen 51
3.5.2 Analyse der positiven Yeast Two - Hybrid Klone 52
3.6 Ergebnisse des Screenings der humanen Gehirn cDNA - Bibliothek 55
3.7 Ergebnisse des Screenings der humanen Herz cDNA - Bibliothek 59
3.8 Bestätigung der Interaktion und Identifizierung von Interaktionsdomänen 64
4 DISKUSSION 70
4.1 Das Yeast Two - Hybrid System 71
4.2 Interaktionspartner von SEPT8_v2 71
4.2.1 SEPT4 71
III
Inhaltsverzeichnis
4.2.2 SEPT5 74
4.2.3 SEPT2 75
4.2.4 SEPT3 76
4.2.5 SEPT7 77
4.2.6 SEPT9 77
4.2.7 Snapin 79
4.2.8 MLLT10 82
4.3 Interaktionsnetzwerk der Septine 83
4.4 Interaktionsdomänen 85
5 ZUSAMMENFASSUNG 87
6 ANHANG 88
6.1 Geräte und Gebrauchsgegenstände 88
6.2 Verbrauchsmaterialien 89
6.3 Chemikalien 90
6.4 Antibiotika 91
6.5 Antikörper und Seren 91
6.6 Kitsysteme 91
6.7 Lösungen, Puffer und Stocklösungen 92
6.8 Lösungen für die DNA - Präparationen 92
6.8.1 Lösungen für die Plasmidisolierung aus Hefe 92
6.8.2 Lösungen für die Alkalische Lyse 92
6.8.3 Lösungen für die Transformation von Hefe 93
6.8.4 Lösungen für die Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 93
6.9 Lösungen für die Präparation/Analyse von Proteinen 93
6.9.1 Lösungen für die Coomasie Blue-Färbung 93
6.9.2 Lösungen für den Western Blot 94
IV
Inhaltsverzeichnis
6.9.3 Lösungen für die Proteinisolierung aus Hefe 94
6.10 Nährmedien 95
6.10.1 Nährmedien für Hefe 95
6.10.2 Nährmedien für Escherichia coli 95
6.11 Oligonukleotide 96
6.12 cDNA-Banken 97
6.13 Größenstandards 97
6.13.1 DNA - Größenstandards 97
6.13.2 Protein - Größenstandards 97
6.14 Enzyme 98
6.15 Abkürzungen 98
7 LITERATURVERZEICHNIS 100
8 DANKSAGUNG 110
V
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Die Septine 1
1.2 Nomenklatur der Septine 2
1.3 Struktur der Septine 4
1.4 Das humane Septin 8 7
1.5 Septinkomplexe 9
1.6 Funktion der Septine 10
1.6.1 Zytokinese 10
1.6.2 Zellorganisation 11
1.6.3 Exozytose 11
1.7 Beteiligung der Septine an pathologischen Prozessen 13
1.7.1 Neoplasien 13
1.7.2 Neurodegenerative Erkrankungen 14
1.8 Das Yeast Two - Hybrid System 15
1.9 Zielsetzung der Arbeit 18
2 MATERIAL UND METHODEN 19
2.1 Material 19
2.1.1 Hefestämme 19
2.1.2 Bakterienstamm 19
2.1.3 Expressionsvektoren 20
2.2 Mikrobiologische Methoden 22
2.2.1 Arbeiten mit Saccharomyces cerevisiae 22
2.2.1.1 Übernacht - Kulturen 22
2.2.1.2 Bestimmung der optischen Dichte 22
2.2.1.3 Aufbewahrung 22
I
Inhaltsverzeichnis
2.2.1.4 Kultivierung auf Agarplatten 23
2.2.2 Arbeiten mit E. coli 23
2.2.2.1 Kultivierung 23
2.2.2.2 Herstellung elektrokompetenter Bakterien 23
2.3 Molekularbiologische Methoden 24
2.3.1 Transfektion 24
2.3.1.1 Transfektion von Hefe 24
2.3.1.2 Cotransfektion von Hefe 25
2.3.1.3 Transfektion von E. coli 26
2.3.2 Isolierung von Plasmid- DNA 26
2.3.2.1 Alkalische Lyse von Bakterien 27
2.3.2.2 Midi - Prep - Kit 28
2.3.2.3 Hefeplasmidisolierung 28
2.3.3 Konzentrationsbestimmung von DNA 29
2.3.4 Restriktionsverdau von DNA 29
2.3.5 Gelelektrophorese von DNA 29
2.3.6 DNA - Sequenzierung 30
2.3.7 Fällung von DNA 31
2.3.7.1 Alkohol - Fällung 31
2.3.7.2 PEG-Fällung 32
2.4 Proteinbiochemische Methoden 33
2.4.1 Isolierung von Hefelysat 33
2.4.2 Isolierung von Proteinen aus Hefezellen 33
2.4.3 SDS - Polyacrylamid - Gelelektrophorese 34
2.4.3.1 Coomassie Blue - Färbung 35
2.4.3.2 Westernblot 35
2.4.3.2.1 Ponceau S Färbung 36
2.4.3.2.2 Immundetektion 36
II
Inhaltsverzeichnis
2.5 Das Yeast Two - Hybrid System 37
2.5.1 Kreuzung von S. cerevisiae 38
2.5.2 Testung des Bait - Proteins auf autonome Aktivierung der Reportergene 39
2.5.3 Kontrollmating 40
2.5.4 Bestimmung des Titers der cDNA - Library 41
2.5.5 Bestimmung der Matingeffizienz 41
2.5.6 Bestimmung der Anzahl der gescreenten Klone 42
2.5.7 Selektion nach einer positiven Yeast Two - Hybrid Interaktion 42
3 ERGEBNISSE 44
3.1 Vektorkonstrukte 44
3.1.1 DNA - BD Vektor Konstrukte 44
3.1.2 DNA - AD Vektor Konstrukte 44
3.2 Untersuchung auf Eignung der Bait - Proteine für das
Yeast Two - Hybrid System 45
3.3 Kontrolle der Matingeffizienz 47
3.4 Nachweis der Expression der Fusionsproteine in transformierten Hefen 48
3.5 Analyse des Yeast Two - Hybrid Screens der humanen
Gehirn-und Herz cDNA - Bank 51
3.5.1 Berechnungen 51
3.5.2 Analyse der positiven Yeast Two - Hybrid Klone 52
3.6 Ergebnisse des Screenings der humanen Gehirn cDNA - Bibliothek 55
3.7 Ergebnisse des Screenings der humanen Herz cDNA - Bibliothek 59
3.8 Bestätigung der Interaktion und Identifizierung von Interaktionsdomänen 64
4 DISKUSSION 70
4.1 Das Yeast Two - Hybrid System 71
4.2 Interaktionspartner von SEPT8_v2 71
4.2.1 SEPT4 71
III
Inhaltsverzeichnis
4.2.2 SEPT5 74
4.2.3 SEPT2 75
4.2.4 SEPT3 76
4.2.5 SEPT7 77
4.2.6 SEPT9 77
4.2.7 Snapin 79
4.2.8 MLLT10 82
4.3 Interaktionsnetzwerk der Septine 83
4.4 Interaktionsdomänen 85
5 ZUSAMMENFASSUNG 87
6 ANHANG 88
6.1 Geräte und Gebrauchsgegenstände 88
6.2 Verbrauchsmaterialien 89
6.3 Chemikalien 90
6.4 Antibiotika 91
6.5 Antikörper und Seren 91
6.6 Kitsysteme 91
6.7 Lösungen, Puffer und Stocklösungen 92
6.8 Lösungen für die DNA - Präparationen 92
6.8.1 Lösungen für die Plasmidisolierung aus Hefe 92
6.8.2 Lösungen für die Alkalische Lyse 92
6.8.3 Lösungen für die Transformation von Hefe 93
6.8.4 Lösungen für die Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 93
6.9 Lösungen für die Präparation/Analyse von Proteinen 93
6.9.1 Lösungen für die Coomasie Blue-Färbung 93
6.9.2 Lösungen für den Western Blot 94
IV
Inhaltsverzeichnis
6.9.3 Lösungen für die Proteinisolierung aus Hefe 94
6.10 Nährmedien 95
6.10.1 Nährmedien für Hefe 95
6.10.2 Nährmedien für Escherichia coli 95
6.11 Oligonukleotide 96
6.12 cDNA-Banken 97
6.13 Größenstandards 97
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6.13.2 Protein - Größenstandards 97
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8 DANKSAGUNG 110
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