Die Bedeutung von CCAAT, enhancer binding protein (C, EBP) b [beta] und suppressor of cytokine signalling (SOCS) 1 & 3 für die Pathogenese der amyotrophen Lateralsklerose (ALS):
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2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
I. Abbilungsverzeichnis X
II. Verzeichnis der Grafiken X
III. Tabellenverzeichnis X
IV. Abkürzungsverzeichnis XI
1 Einleitung
1.1 Epidemiologie und Klinik der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) 1
1.1.1 Sporadische und familiäre Form der ALS 2
1.1.2 Die El Escorial-Kriterien 3
1.2 Pathogenese der ALS 3
1.2.1 Risikofaktoren 3
1.2.2 Autoimmunhypothese 4
1.2.3 Exzitotoxische Hypothese 4
1.2.4 Oxidativer Stress 6
1.2.5 Neurofilamente 7
1.2.6 Kalziumbindende Enzyme 8
1.2.7 Genetische Komponenten 8
1.2.7.1 DastransgeneSODl-Mausmodell 9
1.2.7.2 Die Erkenntnisse aus SOD1 und ihrem Mausmodell 10
1.2.8 Entzündliche Prozesse in der ALS 12
1.2.8.1 Zelluläre inflammatorische Veränderungen bei ALS 12
1.2.8.2 Zytochemische inflammatorische Veränderungen bei ALS 14
1.2.9 Das mögliche Zusammenspiel pathogenetischer Faktoren 17
1.2.9.1 Konsolidierung der Hypothesen 17
1.2.9.2 Wahrscheinliche Konsequenz: Gemeinsame Endstrecke Apoptose 18
1.3 Herleitung der Fragestellung 19
1.3.1 Die SOCS- Familie und ihre Rolle im Entzündungsgeschehen 19
1.3.1.1 Die Biochemie der Signalhemmung durch SOCS 20
1.3.1.2 SOCS-1 21
1.3.1.3 SOCS-3 22
1.3.2 CCAAT/enhancer-binding-protein ß (C/EBP ß) 24
2 Methoden 26
2.1 Verwendetes Tiermodell 26
2.2 Gewebeentnahme und -bearbeitung 27
2.2.1 Gewinnung des Rückenmarks der Mäuse 27
VII
Inhaltsverzeichnis
2.2.2 Humane Rückenmarksproben von Kontroll- und ALS- Patienten 27
2.2.3 Bearbeitung des Gewebes für das Microarray- Experiment 27
2.2.3.1 Isolierung der RNA 27
2.2.3.2 Photometrie und Gel- Elektrophorese 29
2.2.3.3 DNase- Behandlung 30
2.2.4 Bearbeitung des Gewebes für den Western Blot 31
2.2.5 Bearbeitung des Gewebes für die Immunhistochemie 31
2.3 Grundlagen und Technik des DNA Microarray 31
2.3.1 Der verwendete Typ des Microarray 32
2.3.2 Allgemeines Protokoll 33
2.3.3 Design des Microarray Experiments 35
2.4 Verwendete primäre und sekundäre Antikörper 35
2.5 Grundlagen und Technik des Western Blot 36
2.5.1 Photometrische Proteinbestimmung 37
2.5.2 Allgemeines Protokoll 37
2.5.3 Design des Western Blot- Experiments 39
2.6 Grundlagen und Technik der Immunhistochemie 39
2.6.1 Die Herstellung von Gefrierschnitten 40
2.6.2 Beschichtung der Objektträger 40
2.6.3 Allgemeines Protokoll 41
2.6.4 Design des Immunhistochemie-Experiments 41
2.7 Grundlagen der angewandten Zellkulturtechnik 43
2.7.1 Gewinnung der Liquorproben 43
2.7.2 Gewinnung des Rückenmarks aus Hühnerembryonen 43
2.7.3 Beschichtung der Zellkulturplatten 44
2.7.4 Allgemeines Protokoll 44
2.7.5 Design des Zellkultur-Experiments 45
2.8 Statistische Auswertung 46
2.8.1 Bildanalyse des Western Blot 46
2.8.2 Bildanalyse der Immunhistochemie 47
3 Ergebnisse 48
3.1 Methodische Überlegungen 49
3.2 Ergebnisse des Microarray 50
3.3 C/EBP ß 52
vin
Inhaltsverzeichnis
3.3.1 Das Translationsniveau 52
3.3.2 Immunhistochemie 54
3.4 SOCS-1 55
3.4.1 Das Translationsniveau 55
3.4.2 Immunhistochemie 57
3.5 SOCS-3 58
3.5.1 Das Translationsniveau 58
3.5.2 Immunhistochemie 60
3.6 Die Färbung der glialen Zellen 61
3.7 Die Nissl-Färbung 61
3.8 Das Zellkulturexperiment 62
4 Diskussion 64
4.1 Bewertung und Interpretation des Microarray 64
4.2 SOCS-1, Inflammation und das ZNS 65
4.3 SOCS-3, Inflammation und das ZNS 66
4.4 CCAAT/enhancer-binding-protein ß (C/EBP ß) und die ALS? 66
4.5 Von der Transkription zur Translation 68
4.6 Die Zellkultur 70
4.7 Mögliche Wechselwirkungen und ihre Relevanz für die ALS 70
4.8 Mögliche Bedeutung für anti-inflammatorische Therapieansätze 74
5 Zusammenfassung und Ausblick 76
6 Literatur 80
7 Anhang 89
7.1 Lösungen und Puffer 89
7.2 Nachweis der verwendeten Biochemika 93
Danksagung 94
Lebenslauf 95
IX
VERZEICHNISSE
I. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Der vermutliche Weg zur Degeneration von Motoneuronen bei ALS 18
Abbildung 2: Die negative Regulation durch SOCS- Proteine 20
Abbildung 3: Die SOCS- Proteinfamilie 20
Abbildung 4: Möglicher Funktionsmechanismus der SOCS- Proteine 21
Abbildung 5: Bisher bekannte durch SOCS-3 regulierte Signalwege 24
Abbildung 6: Das Blotting- Sandwich 38
Abbildung 7: Beispiel- WB für Actin (Human) 49
Abbildung 8: WB mit Immunopeptid SO
Abbildung 9: C/EBP ß im Tiermodell 52
Abbildung 10: C/EBP ß Verlauf im Tiermodell 53
Abbildung 11: C/EBP ß humane Probe 54
Abbildung 12: lmmunhistochemie im Tiermodell für C/EBP ß (weiße Substanz) 54
Abbildung 13: lmmunhistochemie im Tiermodell für C/EBP ß (Vorderhom) 55
Abbildung 14: lmmunhistochemie für C/EBP ß humane Probe 55
Abbildung 15: SOCS-1 im Tiermodell 56
Abbildung 16: SOCS-1 Verlauf im Tiermodell 57
Abbildung 17: SOCS-1 humane Probe 57
Abbildung 18: lmmunhistochemie im Tiermodell für SOCS-1 (Vorderhorn) 58
Abbildung 19: lmmunhistochemie für SOCS-1 humane Probe 58
Abbildung 20: SOCS-3 im Tiermodell 59
Abbildung 21: SOCS-3 Verlauf im Tiermodell 60
Abbildung 22: SOCS-3 humane Probe 60
Abbildung 23: lmmunhistochemie im Tiermodell für SOCS-3 (Vorderhorn) 61
Abbildung 24: Lectin-/ GFAP- Färbungen 1
Abbildung 25: Nissl- Färbungen 62
Abbildung 26: Das Zellkulturexperiment 63
II. Verzeichnis der Grafiken
Grafik 1: SOD1 Microarray 51
Grafik 2: C/EBP ß WB 53
Grafik 3: SOCS-1 WB 56
Grafik 4: SOCS-3 WB 59
III. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Die El Escorial- Kriterien 3
Tabelle 2: Bekannte Genmutationen der ALS
Tabelle 3: Auswahl von Proteinen die nachweislich mit der Entzündungsreaktion bei ALS assoziiert sind 13
Tabelle 4: Primäre Antikörper 35
Tabelle 5: Sekundäre Antikörper 36
Tabelle 6: Das Microanay- Experiment 51
Tabelle 7: WB SOD1 C/EBP ß 52
Tabelle 8: WB SOD1 Verlauf C/EBP ß 53
Tabelle 9: WB ALS C/EBP ß 54
Tabelle 10: WB SOD1 SOCS-1 56
Tabelle 11: WB SOD1 Verlauf SOCS-1 57
Tabelle 12: WB ALS SOCS-1 57
Tabelle 13: WB SOD1 SOCS-3 59
Tabelle 14: WB SOD1 Verlauf SOCS-3 60
Tabelle IS: WB ALS SOCS-3 60
X
|
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Inhaltsverzeichnis
I. Abbilungsverzeichnis X
II. Verzeichnis der Grafiken X
III. Tabellenverzeichnis X
IV. Abkürzungsverzeichnis XI
1 Einleitung \
1.1 Epidemiologie und Klinik der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) 1
1.1.1 Sporadische und familiäre Form der ALS 2
1.1.2 Die El Escorial-Kriterien 3
1.2 Pathogenese der ALS 3
1.2.1 Risikofaktoren 3
1.2.2 Autoimmunhypothese 4
1.2.3 Exzitotoxische Hypothese 4
1.2.4 Oxidativer Stress 6
1.2.5 Neurofilamente 7
1.2.6 Kalziumbindende Enzyme 8
1.2.7 Genetische Komponenten 8
1.2.7.1 DastransgeneSODl-Mausmodell 9
1.2.7.2 Die Erkenntnisse aus SOD1 und ihrem Mausmodell 10
1.2.8 Entzündliche Prozesse in der ALS 12
1.2.8.1 Zelluläre inflammatorische Veränderungen bei ALS 12
1.2.8.2 Zytochemische inflammatorische Veränderungen bei ALS 14
1.2.9 Das mögliche Zusammenspiel pathogenetischer Faktoren 17
1.2.9.1 Konsolidierung der Hypothesen 17
1.2.9.2 Wahrscheinliche Konsequenz: Gemeinsame Endstrecke Apoptose 18
1.3 Herleitung der Fragestellung 19
1.3.1 Die SOCS- Familie und ihre Rolle im Entzündungsgeschehen 19
1.3.1.1 Die Biochemie der Signalhemmung durch SOCS 20
1.3.1.2 SOCS-1 21
1.3.1.3 SOCS-3 22
1.3.2 CCAAT/enhancer-binding-protein ß (C/EBP ß) 24
2 Methoden 26
2.1 Verwendetes Tiermodell 26
2.2 Gewebeentnahme und -bearbeitung 27
2.2.1 Gewinnung des Rückenmarks der Mäuse 27
VII
Inhaltsverzeichnis
2.2.2 Humane Rückenmarksproben von Kontroll- und ALS- Patienten 27
2.2.3 Bearbeitung des Gewebes für das Microarray- Experiment 27
2.2.3.1 Isolierung der RNA 27
2.2.3.2 Photometrie und Gel- Elektrophorese 29
2.2.3.3 DNase- Behandlung 30
2.2.4 Bearbeitung des Gewebes für den Western Blot 31
2.2.5 Bearbeitung des Gewebes für die Immunhistochemie 31
2.3 Grundlagen und Technik des DNA Microarray 31
2.3.1 Der verwendete Typ des Microarray 32
2.3.2 Allgemeines Protokoll 33
2.3.3 Design des Microarray Experiments 35
2.4 Verwendete primäre und sekundäre Antikörper 35
2.5 Grundlagen und Technik des Western Blot 36
2.5.1 Photometrische Proteinbestimmung 37
2.5.2 Allgemeines Protokoll 37
2.5.3 Design des Western Blot- Experiments 39
2.6 Grundlagen und Technik der Immunhistochemie 39
2.6.1 Die Herstellung von Gefrierschnitten 40
2.6.2 Beschichtung der Objektträger 40
2.6.3 Allgemeines Protokoll 41
2.6.4 Design des Immunhistochemie-Experiments 41
2.7 Grundlagen der angewandten Zellkulturtechnik 43
2.7.1 Gewinnung der Liquorproben 43
2.7.2 Gewinnung des Rückenmarks aus Hühnerembryonen 43
2.7.3 Beschichtung der Zellkulturplatten 44
2.7.4 Allgemeines Protokoll 44
2.7.5 Design des Zellkultur-Experiments 45
2.8 Statistische Auswertung 46
2.8.1 Bildanalyse des Western Blot 46
2.8.2 Bildanalyse der Immunhistochemie 47
3 Ergebnisse 48
3.1 Methodische Überlegungen 49
3.2 Ergebnisse des Microarray 50
3.3 C/EBP ß 52
vin
Inhaltsverzeichnis
3.3.1 Das Translationsniveau 52
3.3.2 Immunhistochemie 54
3.4 SOCS-1 55
3.4.1 Das Translationsniveau 55
3.4.2 Immunhistochemie 57
3.5 SOCS-3 58
3.5.1 Das Translationsniveau 58
3.5.2 Immunhistochemie 60
3.6 Die Färbung der glialen Zellen 61
3.7 Die Nissl-Färbung 61
3.8 Das Zellkulturexperiment 62
4 Diskussion 64
4.1 Bewertung und Interpretation des Microarray 64
4.2 SOCS-1, Inflammation und das ZNS 65
4.3 SOCS-3, Inflammation und das ZNS 66
4.4 CCAAT/enhancer-binding-protein ß (C/EBP ß) und die ALS? 66
4.5 Von der Transkription zur Translation 68
4.6 Die Zellkultur 70
4.7 Mögliche Wechselwirkungen und ihre Relevanz für die ALS 70
4.8 Mögliche Bedeutung für anti-inflammatorische Therapieansätze 74
5 Zusammenfassung und Ausblick 76
6 Literatur 80
7 Anhang 89
7.1 Lösungen und Puffer 89
7.2 Nachweis der verwendeten Biochemika 93
Danksagung 94
Lebenslauf 95
IX
VERZEICHNISSE
I. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Der vermutliche Weg zur Degeneration von Motoneuronen bei ALS 18
Abbildung 2: Die negative Regulation durch SOCS- Proteine 20
Abbildung 3: Die SOCS- Proteinfamilie 20
Abbildung 4: Möglicher Funktionsmechanismus der SOCS- Proteine 21
Abbildung 5: Bisher bekannte durch SOCS-3 regulierte Signalwege 24
Abbildung 6: Das Blotting- Sandwich 38
Abbildung 7: Beispiel- WB für Actin (Human) 49
Abbildung 8: WB mit Immunopeptid SO
Abbildung 9: C/EBP ß im Tiermodell 52
Abbildung 10: C/EBP ß Verlauf im Tiermodell 53
Abbildung 11: C/EBP ß humane Probe 54
Abbildung 12: lmmunhistochemie im Tiermodell für C/EBP ß (weiße Substanz) 54
Abbildung 13: lmmunhistochemie im Tiermodell für C/EBP ß (Vorderhom) 55
Abbildung 14: lmmunhistochemie für C/EBP ß humane Probe 55
Abbildung 15: SOCS-1 im Tiermodell 56
Abbildung 16: SOCS-1 Verlauf im Tiermodell 57
Abbildung 17: SOCS-1 humane Probe 57
Abbildung 18: lmmunhistochemie im Tiermodell für SOCS-1 (Vorderhorn) 58
Abbildung 19: lmmunhistochemie für SOCS-1 humane Probe 58
Abbildung 20: SOCS-3 im Tiermodell 59
Abbildung 21: SOCS-3 Verlauf im Tiermodell 60
Abbildung 22: SOCS-3 humane Probe 60
Abbildung 23: lmmunhistochemie im Tiermodell für SOCS-3 (Vorderhorn) 61
Abbildung 24: Lectin-/ GFAP- Färbungen '1
Abbildung 25: Nissl- Färbungen 62
Abbildung 26: Das Zellkulturexperiment 63
II. Verzeichnis der Grafiken
Grafik 1: SOD1 Microarray 51
Grafik 2: C/EBP ß WB 53
Grafik 3: SOCS-1 WB 56
Grafik 4: SOCS-3 WB 59
III. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Die El Escorial- Kriterien 3
Tabelle 2: Bekannte Genmutationen der ALS '
Tabelle 3: Auswahl von Proteinen die nachweislich mit der Entzündungsreaktion bei ALS assoziiert sind 13
Tabelle 4: Primäre Antikörper 35
Tabelle 5: Sekundäre Antikörper 36
Tabelle 6: Das Microanay- Experiment 51
Tabelle 7: WB SOD1 C/EBP ß 52
Tabelle 8: WB SOD1 Verlauf C/EBP ß 53
Tabelle 9: WB ALS C/EBP ß 54
Tabelle 10: WB SOD1 SOCS-1 56
Tabelle 11: WB SOD1 Verlauf SOCS-1 57
Tabelle 12: WB ALS SOCS-1 57
Tabelle 13: WB SOD1 SOCS-3 59
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