Quantitative Zytokinexpression unter Methotrexattherapie bei Mäusen mit experimentell-autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE):
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Seite
Abkürzungsverzeichnis 7
Bilderverzeichnis 9
Tabellenverzeichnis 9
1. Vorwort 10
2. Einleitung 11
2.1. Multiple Sklerose 11
2.2. Methotrexat (MTX) 13
2.3. EAE (Tiermodell) 14
2.4. Zytokine 16
2.4.1. IL-6 16
2.4.2. IL-lß 17
2.4.3. TNF-a 18
2.4.4. ICE 19
2.4.5. IL-10 19
2.4.6. TGF-ß 20
2.4.7. GMCSF 21
2.5. Tumorbezogene Parameter 21
2.5.1. p53 22
2.5.2. bcl-2 23
2.5.3. c-myc 24
2.6. PCR mit dem LightCycler 24
2.7. Zielstellung 27
3. Material und Methoden 28
3.1. Tierversuch 28
3.1.1. Versuchsaufbau 28
3.1.2. Induktion von EAE 29
3.1.3. Klinische Einteilung der Tiere und Behandlung 30
3.2. Präparation der Gewebe und molekularbiologische Untersuchung 31
3.2.1. Geräte und Materialien 31
3.2.2. Entnahme der Gewebe 35
3.2.3. RNA-Präparation mit TriReagent 36
3.2.4. Konzentrationsbestimmung der RNA 36
3.2.5. Verdau der DNA 37
3.2.6. Fällung der RNA 37
3.2.7. Reverse Transkription der RNA in cDNA 37
3.2.8. Semiquantitative PCR mit dem LightCycler 38
3.2.9. Gelelektrophorese 39
3.3. Auswertung der Daten 40
4. Ergebnisse 43
4.1. Tierversuch 43
4.2. RNA-Isolation aus den Geweben 44
4.3. semiquantitative PCR mit dem LightCycler 44
4.4. Gelelektrophorese 49
4.5. Auswertung der Daten 50
4.5.1. IL-6 51
4.5.2. IL-lß 52
4.5.3. TNF-a 53
4.5.4. ICE 54
4.5.5. IL-10 55
4.5.6. TGF-ß 56
4.5.7. GMCSF 57
4.5.8. p53 58
4.5.9. bcl-2 59
4.5.10. c-myc 60
4.6. Zusammenfassung zur relativen Genexpression 61
5. Diskussion 63
5.1. Tierversuch und MTX-Therapie 63
5.2. Quantitative Untersuchung von mRNA mittels LightCycler 64
5.3. Beurteilung der einzelnen untersuchten Zytokine und tumorbezogenen Parameter 65
5.3.1. IL-6 65
5.3.2. IL-lß 65
5.3.3. TNF-a 66
5.3.4. ICE 66
5.3.5. IL-10 67
5.3.6. TGF-ß 67
5.3.7. GMCSF 68
5.3.8. p53 68
5.3.9. bcl-2 68
5.3.10. c-myc 69
5.4. Zusammenfassende Diskussion und Fehlerbetrachtung 70
6. Zusammenfassung der Arbeit 72
7. Literaturverzeichnis 76
8. Anhang 86
8.1. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-6 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 87
8.2. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-1 ß in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 89
8.3. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von TNF-a in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 91
8.4. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von ICE in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 93
8.5. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-10 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 96
8.6. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von TGF-ß in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 98
8.7. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von GMCSF in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 101
8.8. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von p53 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 103
8.9. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von bcl-2 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 106
8.10. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von c-myc in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 109
8.11. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-6 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 111
8.12. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-1 ß in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 114
8.13. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von TNF-a in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 117
8.14. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von ICE in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 120
8.15. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-10 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 123
8.16. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von TGF-ß in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 126
8.17. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von GMCSF in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 129
8.18. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von p53 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 132
8.19. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von bcl-2 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 134
8.20. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von c-myc in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 137
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 140
Lebenslauf. 141
|
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Inhaltsverzeichnis
Seite
Abkürzungsverzeichnis 7
Bilderverzeichnis 9
Tabellenverzeichnis 9
1. Vorwort 10
2. Einleitung 11
2.1. Multiple Sklerose 11
2.2. Methotrexat (MTX) 13
2.3. EAE (Tiermodell) 14
2.4. Zytokine 16
2.4.1. IL-6 16
2.4.2. IL-lß 17
2.4.3. TNF-a 18
2.4.4. ICE 19
2.4.5. IL-10 19
2.4.6. TGF-ß 20
2.4.7. GMCSF 21
2.5. Tumorbezogene Parameter 21
2.5.1. p53 22
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2.6. PCR mit dem LightCycler 24
2.7. Zielstellung 27
3. Material und Methoden 28
3.1. Tierversuch 28
3.1.1. Versuchsaufbau 28
3.1.2. Induktion von EAE 29
3.1.3. Klinische Einteilung der Tiere und Behandlung 30
3.2. Präparation der Gewebe und molekularbiologische Untersuchung 31
3.2.1. Geräte und Materialien 31
3.2.2. Entnahme der Gewebe 35
3.2.3. RNA-Präparation mit TriReagent 36
3.2.4. Konzentrationsbestimmung der RNA 36
3.2.5. Verdau der DNA 37
3.2.6. Fällung der RNA 37
3.2.7. Reverse Transkription der RNA in cDNA 37
3.2.8. Semiquantitative PCR mit dem LightCycler 38
3.2.9. Gelelektrophorese 39
3.3. Auswertung der Daten 40
4. Ergebnisse 43
4.1. Tierversuch 43
4.2. RNA-Isolation aus den Geweben 44
4.3. semiquantitative PCR mit dem LightCycler 44
4.4. Gelelektrophorese 49
4.5. Auswertung der Daten 50
4.5.1. IL-6 51
4.5.2. IL-lß 52
4.5.3. TNF-a 53
4.5.4. ICE 54
4.5.5. IL-10 55
4.5.6. TGF-ß 56
4.5.7. GMCSF 57
4.5.8. p53 58
4.5.9. bcl-2 59
4.5.10. c-myc 60
4.6. Zusammenfassung zur relativen Genexpression 61
5. Diskussion 63
5.1. Tierversuch und MTX-Therapie 63
5.2. Quantitative Untersuchung von mRNA mittels LightCycler 64
5.3. Beurteilung der einzelnen untersuchten Zytokine und tumorbezogenen Parameter 65
5.3.1. IL-6 65
5.3.2. IL-lß 65
5.3.3. TNF-a 66
5.3.4. ICE 66
5.3.5. IL-10 67
5.3.6. TGF-ß 67
5.3.7. GMCSF 68
5.3.8. p53 68
5.3.9. bcl-2 68
5.3.10. c-myc 69
5.4. Zusammenfassende Diskussion und Fehlerbetrachtung 70
6. Zusammenfassung der Arbeit 72
7. Literaturverzeichnis 76
8. Anhang 86
8.1. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-6 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 87
8.2. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-1 ß in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 89
8.3. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von TNF-a in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 91
8.4. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von ICE in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 93
8.5. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-10 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 96
8.6. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von TGF-ß in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 98
8.7. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von GMCSF in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 101
8.8. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von p53 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 103
8.9. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von bcl-2 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 106
8.10. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von c-myc in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis und Behandlungszeitpunkt) 109
8.11. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-6 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 111
8.12. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-1 ß in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 114
8.13. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von TNF-a in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 117
8.14. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von ICE in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 120
8.15. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von IL-10 in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 123
8.16. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von TGF-ß in den
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8.17. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von GMCSF in den
einzelnen Organen (Unterscheidung nach Therapiedosis) 129
8.18. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von p53 in den
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8.19. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von bcl-2 in den
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8.20. Zusammenfassende Darstellung der relativen mRNA-Expression von c-myc in den
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