Rolle der mitochondrialen Atmungskette bei der UVA-induzierten Zellschädigung von humanen Fibroblasten und Keratinozyten:
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2007
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abkürzungen
1. Einleitung
1.1. Haut und UV-Strahlung 1
1.1.1. Die Haut als äu Berste Barriere 1
1.1.2. Der Aufbau der Haut 1
1.1.3. Die Haut als Barriere für UV-Strahlung 2
1.1.4. Wirkung von UV-Strahlung auf die Haut 5
1.2. Oxidativer Stress 6
1.2.1. Photodynamische Reaktionen 7
1.2.2. Reaktive Sauerstoffspezies 7
1.2.3. ROS-induzierte Schäden 9
1.2.4. Zelluläre Schutzmechanismen gegen oxidative Schäden 10
1.3. Mitochondrien 11
1.3.1. Struktur und Funktion der Mitochondrien 13
1.3.2. Oxidative Phosphorylierung in der Atmungskette 15
1.3.3. ROS Entstehung in der mitochondrialen Atmungskette 17
1.3.4. p-Zellen 18
1.4. Die Elektronentransportkette als UVA1 -Ziel 19
1.5. Ziel dieser Arbeit 20
2. Material
2.1. Geräte 21
2.2. Material 22
2.3. Chemikalien, Lösungen 23
2.4. Puffer 28
2.5. Antikörper 30
2.6. Marker 31
2.7. Zellen 31
3. Methoden
3.1. Zellkultur 32
3.1.1. Isolierung von Hautzellen 32
3.1.2. Kultivierung 33
3.1.3. Kumulative Populationsverdopplung 34
3.1.4. Einfrieren; Auftauen von Zellen 34
3.2. Ethidiumbromidbehandlung 32
3.3. Vitalitätstests 36
3.3.1. MTT-Test 36
3.3.2. NR-Test 37
3.4. Sauerstoffmessung 37
3.4.1. Vorbereitung der Elektrode 38
3.4.2. Vorbereitung der Zellen 39
3.4.3. Messung 40
3.4.4. Zellzählung 40
3.5. Arbeiten mit Proteinen 40
3.5.1. Proteinextraktion mit CHAPS 40
3.5.2. Proteinquantifizierung 41
3.5.3. Poinceau S-Färbung von Proteinen 41
3.5.4. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 42
3.5.5. Western Blot 43
3.5.6. Immunologische Proteindetektion 45
3.5.7. Detektion mittels Radiographie 45
3.6. UVA1-Bestrahlung 46
3.6.1. Vorbereitung der Zellen 46
3.6.2. Bestrahlung 46
4. Ergebnisse
4.1. Ethidiumbromid-Behandlung zur Herstellung von p-Hautzellen 48
4.1.1. Vitalität Ethidiumbromid -behandelter Hautzellen 48
4.1.1.1. Keratinozyten
4.1.1.2. Fibroblasten
4.1.2. Reduzierung des Sauerstoffverbrauchs von Hautzellen durch
Ethidiumbromid -Behandlung 55
4.1.2.1. Keratinozyten
4.1.2.2. Nicht KCN-inhibierbare Atmung bei Keratinozyten
4.1.2.3. Fibroblasten
4.1.3. Verlaufskurven der Atmungsaktivität von Hautzellen während der
Ethidiumbromid -Behandlung und anschließender Erholung 60
4.1.3.1. Keratinozyten
4.1.3.2. Fibroblasten
4.1.4. Expression mitochondrialer Proteine in p -Hautzellen 63
4.2. Schädigung von p+- und p -Hautzellen durch UVA1-Strahlung 67
4.2.1. Toleranz von Hautzellen gegenüber verschiedenen Dosen UVA1 67
4.2.1.1. Keratinozyten
4.2.1.2. Fibroblasten
4.2.2. Interaktion UVA und Ethidiumbromid 70
4.2.3. Vitalität der Zellen nach UVA1 -Bestrahlung 70
4.2.3.1. Keratinozyten
4.2.3.2. Fibroblasten
5. Diskussion
5.1. Die Elektronentransportkette als UVA1-Ziel 74
5.2. 143B- und HeLa-Zellen: UVA1 -Sensibilität von wt- gegenüber
p°-Zellen 74
5.3. Ethidiumbromid-Behandlung führt zur Verminderung der mtDNA 75
5.4. Ethidiumbromid reduziert die Wachstumsrate der Zellen 76
5.5. Reversible Effekte von Ethidiumbromid 77
5.6. Sauerstoffabhängigkeit des Energiestoffwechsels der Epidermis 78
5.7. mtDNA-Reduktion durch Ethidiumbromid führt zur
Verminderung des Sauerstoffverbrauchs der Zelle 79
5.8. Erhöhte tPMET-Aktivität in p -Zellen beeinflusst Reduktion von
Tetrazoliumsalz 79
5.9. Erhöhung von tPMET führt zu Erhöhung nicht KCN-inhibierbarer
Atmung 80
5.10. Verwendung primärer Keratinozyten für Bestrahlungsversuche 83
5.11. Fibroblasten reagieren sensibler auf UVA1 -Strahlung als
Keratinozyten 83
5.12. Eine reduzierte Elektronentransportketten-Aktivität bietet den
Hautzellen keinen besseren UVA1-Schutz 84
5.13. Fazit: Die Elektronentransportkette ist nicht wichtigstes Ziel für
UVA1-vermittelten Zelltod 85
5.14. Erhöhte Sensibilität von p-Zellen auf UVA1 -Strahlung 86
6. Zusammenfassung 87
7. Literaturverzeichnis 89
8. Vorabveröffentlichung 100
Lebenslauf
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abb. 1: Interaktion Haut und UV-Strahlung
Abb. 2: Mitochondrium
Abb. 3: Atmungskette und ROS-Entstehung
Abb. 4: Vitalität von Keratinozyten nach 6 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung
(NR-Test)
Abb. 5 a-c: Keratinozyten in Kultur
Abb. 6 a: Vitalität von Fibroblasten nach 10 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung
(NR-Test)
Abb. 6 b: Vitalität von Fibroblasten nach 10 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung
(MTT-Test)
Abb. 7 a-b: Fibroblasten in Kultur
Abb. 8: Sauerstoffverbrauch von Keratinozyten nach 6 Tagen
Ethidiumbromid-Behandlung und 1 Tag in Ethidiumbromid-freiem
Medium
Abb. 9: Sauerstoffverbrauch von Keratinozyten nach 6 Tagen
Ethidiumbromid-Behandlung
Abb. 10: KCN-inhibierbarer Sauerstoffverbrauch von Fibroblasten nach
9 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung + 1 Tag in EtBr-freiem
Medium, nach 10 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung und von
unbehandelten Fibroblasten
Abb. 11: Nicht KCN-inhibierbarer Sauerstoffverbrauch von Fibroblasten nach
9 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung + 1 Tag in EtBr-freiem Medium,
nach 10 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung und von unbehandelten
Fibroblasten
Abb. 12: Verlaufskurve des (VVerbrauchs während der EtBr-Behandlung
bei Keratinozyten
Abb. 13: Verlaufskurve des O2-Verbrauchs während und nach der
EtBr-Behandlung bei Fibroblasten
Abb. 14: Western Blot TFAM
Abb. 15: Western Blot COX I
Abb. 16: Western Blot Aktin
Abb. 17: Vitalität von Keratinozyten nach UVA1 -Bestrahlung (NR-Test)
Abb. 18: Vitalität von Fibroblasten UVA1 -Bestrahlung (N R-Test)
Abb. 19: UVA1-Bestrahlung von p -Keratinozyten (NR-Test)
Abb. 20: UVA1-Bestrahlung von p -Fibroblasten (NR-Test)
Tab. 1: Vergleich der in dieser Arbeit verwendeten Bestrahlungsstärken und -
dosen mit der natürlichen Situation in Mitteleuropa
Tab. 2: Zusammensetzung der Atmungskettenkomplexe und Herkunft der
einzelnen Untereinheiten
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abkürzungen
1. Einleitung
1.1. Haut und UV-Strahlung 1
1.1.1. Die Haut als äu Berste Barriere 1
1.1.2. Der Aufbau der Haut 1
1.1.3. Die Haut als Barriere für UV-Strahlung 2
1.1.4. Wirkung von UV-Strahlung auf die Haut 5
1.2. Oxidativer Stress 6
1.2.1. Photodynamische Reaktionen 7
1.2.2. Reaktive Sauerstoffspezies 7
1.2.3. ROS-induzierte Schäden 9
1.2.4. Zelluläre Schutzmechanismen gegen oxidative Schäden 10
1.3. Mitochondrien 11
1.3.1. Struktur und Funktion der Mitochondrien 13
1.3.2. Oxidative Phosphorylierung in der Atmungskette 15
1.3.3. ROS Entstehung in der mitochondrialen Atmungskette 17
1.3.4. p-Zellen 18
1.4. Die Elektronentransportkette als UVA1 -Ziel 19
1.5. Ziel dieser Arbeit 20
2. Material
2.1. Geräte 21
2.2. Material 22
2.3. Chemikalien, Lösungen 23
2.4. Puffer 28
2.5. Antikörper 30
2.6. Marker 31
2.7. Zellen 31
3. Methoden
3.1. Zellkultur 32
3.1.1. Isolierung von Hautzellen 32
3.1.2. Kultivierung 33
3.1.3. Kumulative Populationsverdopplung 34
3.1.4. Einfrieren; Auftauen von Zellen 34
3.2. Ethidiumbromidbehandlung 32
3.3. Vitalitätstests 36
3.3.1. MTT-Test 36
3.3.2. NR-Test 37
3.4. Sauerstoffmessung 37
3.4.1. Vorbereitung der Elektrode 38
3.4.2. Vorbereitung der Zellen 39
3.4.3. Messung 40
3.4.4. Zellzählung 40
3.5. Arbeiten mit Proteinen 40
3.5.1. Proteinextraktion mit CHAPS 40
3.5.2. Proteinquantifizierung 41
3.5.3. Poinceau S-Färbung von Proteinen 41
3.5.4. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 42
3.5.5. Western Blot 43
3.5.6. Immunologische Proteindetektion 45
3.5.7. Detektion mittels Radiographie 45
3.6. UVA1-Bestrahlung 46
3.6.1. Vorbereitung der Zellen 46
3.6.2. Bestrahlung 46
4. Ergebnisse
4.1. Ethidiumbromid-Behandlung zur Herstellung von p-Hautzellen 48
4.1.1. Vitalität Ethidiumbromid -behandelter Hautzellen 48
4.1.1.1. Keratinozyten
4.1.1.2. Fibroblasten
4.1.2. Reduzierung des Sauerstoffverbrauchs von Hautzellen durch
Ethidiumbromid -Behandlung 55
4.1.2.1. Keratinozyten
4.1.2.2. Nicht KCN-inhibierbare Atmung bei Keratinozyten
4.1.2.3. Fibroblasten
4.1.3. Verlaufskurven der Atmungsaktivität von Hautzellen während der
Ethidiumbromid -Behandlung und anschließender Erholung 60
4.1.3.1. Keratinozyten
4.1.3.2. Fibroblasten
4.1.4. Expression mitochondrialer Proteine in p"-Hautzellen 63
4.2. Schädigung von p+- und p -Hautzellen durch UVA1-Strahlung 67
4.2.1. Toleranz von Hautzellen gegenüber verschiedenen Dosen UVA1 67
4.2.1.1. Keratinozyten
4.2.1.2. Fibroblasten
4.2.2. Interaktion UVA und Ethidiumbromid 70
4.2.3. Vitalität der Zellen nach UVA1 -Bestrahlung 70
4.2.3.1. Keratinozyten
4.2.3.2. Fibroblasten
5. Diskussion
5.1. Die Elektronentransportkette als UVA1-Ziel 74
5.2. 143B- und HeLa-Zellen: UVA1 -Sensibilität von wt- gegenüber
p°-Zellen 74
5.3. Ethidiumbromid-Behandlung führt zur Verminderung der mtDNA 75
5.4. Ethidiumbromid reduziert die Wachstumsrate der Zellen 76
5.5. Reversible Effekte von Ethidiumbromid 77
5.6. Sauerstoffabhängigkeit des Energiestoffwechsels der Epidermis 78
5.7. mtDNA-Reduktion durch Ethidiumbromid führt zur
Verminderung des Sauerstoffverbrauchs der Zelle 79
5.8. Erhöhte tPMET-Aktivität in p -Zellen beeinflusst Reduktion von
Tetrazoliumsalz 79
5.9. Erhöhung von tPMET führt zu Erhöhung nicht KCN-inhibierbarer
Atmung 80
5.10. Verwendung primärer Keratinozyten für Bestrahlungsversuche 83
5.11. Fibroblasten reagieren sensibler auf UVA1 -Strahlung als
Keratinozyten 83
5.12. Eine reduzierte Elektronentransportketten-Aktivität bietet den
Hautzellen keinen besseren UVA1-Schutz 84
5.13. Fazit: Die Elektronentransportkette ist nicht wichtigstes Ziel für
UVA1-vermittelten Zelltod 85
5.14. Erhöhte Sensibilität von p-Zellen auf UVA1 -Strahlung 86
6. Zusammenfassung 87
7. Literaturverzeichnis 89
8. Vorabveröffentlichung 100
Lebenslauf
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abb. 1: Interaktion Haut und UV-Strahlung
Abb. 2: Mitochondrium
Abb. 3: Atmungskette und ROS-Entstehung
Abb. 4: Vitalität von Keratinozyten nach 6 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung
(NR-Test)
Abb. 5 a-c: Keratinozyten in Kultur
Abb. 6 a: Vitalität von Fibroblasten nach 10 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung
(NR-Test)
Abb. 6 b: Vitalität von Fibroblasten nach 10 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung
(MTT-Test)
Abb. 7 a-b: Fibroblasten in Kultur
Abb. 8: Sauerstoffverbrauch von Keratinozyten nach 6 Tagen
Ethidiumbromid-Behandlung und 1 Tag in Ethidiumbromid-freiem
Medium
Abb. 9: Sauerstoffverbrauch von Keratinozyten nach 6 Tagen
Ethidiumbromid-Behandlung
Abb. 10: KCN-inhibierbarer Sauerstoffverbrauch von Fibroblasten nach
9 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung + 1 Tag in EtBr-freiem
Medium, nach 10 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung und von
unbehandelten Fibroblasten
Abb. 11: Nicht KCN-inhibierbarer Sauerstoffverbrauch von Fibroblasten nach
9 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung + 1 Tag in EtBr-freiem Medium,
nach 10 Tagen Ethidiumbromid-Behandlung und von unbehandelten
Fibroblasten
Abb. 12: Verlaufskurve des (VVerbrauchs während der EtBr-Behandlung
bei Keratinozyten
Abb. 13: Verlaufskurve des O2-Verbrauchs während und nach der
EtBr-Behandlung bei Fibroblasten
Abb. 14: Western Blot TFAM
Abb. 15: Western Blot COX I
Abb. 16: Western Blot Aktin
Abb. 17: Vitalität von Keratinozyten nach UVA1 -Bestrahlung (NR-Test)
Abb. 18: Vitalität von Fibroblasten UVA1 -Bestrahlung (N R-Test)
Abb. 19: UVA1-Bestrahlung von p' -Keratinozyten (NR-Test)
Abb. 20: UVA1-Bestrahlung von p' -Fibroblasten (NR-Test)
Tab. 1: Vergleich der in dieser Arbeit verwendeten Bestrahlungsstärken und -
dosen mit der natürlichen Situation in Mitteleuropa
Tab. 2: Zusammensetzung der Atmungskettenkomplexe und Herkunft der
einzelnen Untereinheiten |
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