Quantifizierung der viralen DNA-Synthese im produktiven Infektionszyklus humaner Adenoviren durch Echtzeit-PCR:
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2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Abkürzungen 4
2 Einleitung 5
2.1 Adcnovircn 5
2.1.1 Klassifikation 5
2.1.2 Struktur und Genomorganisation 5
2.1.3 Produktiver Infektionszyklus 8
2.2 Das ElB-55kDa-Protein 9
2.3 DNA-Synthcsc 10
2.4 DNA-Nachweis 13
2.5 Aufgabenstellung 16
3 Material 17
3.1 Säugerzclllinicn 17
3.2 Adenoviren 17
3.3 Plasraidc 18
3.4 Oligonukleotide 18
3.5 Antikörper 19
3.5.1 Primärantikörper 19
3.5.2 Sekundärantikörper 19
3.6 Chemikalien, Reagenzion und Verbrauchsmaterial 20
3.7 Größen- und Molekulargewichtsstandards 20
3.8 Computerprogramme und Datenbanken 20
4 Methoden 21
4.1 Gewebekultur 21
4.1.1 Vermehrung und Aufbewahrung von Zellen 21
4.1.2 Lagerung von Säugcrzellen 22
4.1.3 Bestimmung der Gesamt-Zcllzahl 22
4.1.4 Infektion von Säiigerzellen mit Adenoviren 22
4.1.5 Zellcrnte 23
4.1.6 Gewinnung von Gcsamtzcllcxtrakt 24
4.2 Adenoviren 24
4.2.1 Herstellung von Virusstammlösungen 24
2
Inhaltsverzeichnis
4.2.2 Titerbestinimung von Virusstammlösungen 25
4.3 DNA-Techniken 26
4.3.1 DNA-Extraktion 26
4.3.2 DNA-Agarose-Gelelektrophorese 27
4.3.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 28
4.3.4 Quantitative Echtzeit-PCR 29
4.4 Protein-Techniken 31
4.4.1 Methanolfixieiung 31
4.4.2 Quantitative Bestimmung von Proteinkonzentrationen 31
4.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 31
4.4.4 Western Blot 33
5 Ergebnisse 35
5.1 Etablierung der quantitativen Echtzeit-PCR 35
5.1.1 Evaluierung der Startermoleküle (primer) 35
5.1.2 Überprüfung der DNA-Extraktion 38
5.1.3 Optimierung der Echtzeit-PCR 39
5.1.4 Schmelzkurvenanalysen 39
5.1.5 Entwicklung von Standardkurven zur Quantifizierung der DNA ¦ 42
5.2 Quantifizierung der viralen DNA-Synthese 47
5.2.1 Virale DNA-Synthese in A549-Zellen 48
5.2.2 Virale DNA-Synthese in HeLa-Zellen 53
5.3 Gleichgewichtsmengen wichtiger Proteine für die virale DNA-Replikation 58
5.3.1 Gleichgewichtsmengen der viralen DNA-Polymerase 59
5.3.2 Gleichgewichtsmengen des terminalen Proteins ^
5.3.3 Gleichgewichtsmengen des E2A-72kDa-Proteins cü
5.3.4 Gleichgewichtsmengen des E4orfC-/-17kDa-Proteins cl
6 Diskussion 64
ü.l Methodische Aspekte zur Quantifizierung mittels Echtzeit-PCR 64
6.2 Die virale DNA-Synthese 69
7 Zusammenfassung 73
3
|
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Abkürzungen 4
2 Einleitung 5
2.1 Adcnovircn 5
2.1.1 Klassifikation 5
2.1.2 Struktur und Genomorganisation 5
2.1.3 Produktiver Infektionszyklus 8
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2.5 Aufgabenstellung 16
3 Material 17
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4.2 Adenoviren 24
4.2.1 Herstellung von Virusstammlösungen 24
2
Inhaltsverzeichnis
4.2.2 Titerbestinimung von Virusstammlösungen 25
4.3 DNA-Techniken 26
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4.4 Protein-Techniken 31
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5 Ergebnisse 35
5.1 Etablierung der quantitativen Echtzeit-PCR 35
5.1.1 Evaluierung der Startermoleküle (primer) 35
5.1.2 Überprüfung der DNA-Extraktion 38
5.1.3 Optimierung der Echtzeit-PCR 39
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5.2 Quantifizierung der viralen DNA-Synthese 47
5.2.1 Virale DNA-Synthese in A549-Zellen 48
5.2.2 Virale DNA-Synthese in HeLa-Zellen 53
5.3 Gleichgewichtsmengen wichtiger Proteine für die virale DNA-Replikation 58
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