Aptamere als neue molekulare Erkennungselemente in Biosensoren:
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Leipzig
Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung
2007
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2007,11 |
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis..............................................................................................................................VII
Abkürzungsverzeichnis.......................................................................................................................X
Abbildungsverzeichnis......................................................................................................................XII
Tabellenverzeichnis..........................................................................................................................XIV
1 Einleitung......................................................................................................................................1
2 Zielstellung....................................................................................................................................2
3 Theoretischer Teil.........................................................................................................................4
3.1 Biosensoren............................................................................................................................4
3.1.1 Aufbau und Funktion..........................................................................................................4
3.1.2 Transducer.........................................................................................................................5
3.1.3 Biorezeptoren.....................................................................................................................7
3.2 Aptamere................................................................................................................................8
3.2.1 Struktur und Funktionsweise..............................................................................................8
3.2.2 Eigenschaften von Aptameren.........................................................................................11
3.2.3 Einsatz von Aptameren....................................................................................................12
3.2.4 in vitro Selektion zur Gewinnung von Aptameren............................................................12
3.2.4.1 Prinzip.......................................................................................................................12
3.2.4.2 SELEX-Varianten.....................................................................................................15
3.2.4.3 RuMag-SELEX.........................................................................................................16
3.3 Verwendete Targets für die Aptamergewinnung..................................................................17
3.3.1 Schimmelpilzsporen.........................................................................................................17
3.3.1.1 Schimmelpilze..........................................................................................................17
3.3.1.2 Etablierte Nachweismethoden..................................................................................19
3.3.1.3 Konidien und deren Bestandteile als Targets im SELEX-Prozess...........................20
3.3.2 Ethanolamin......................................................................................................................23
4 Experimenteller Teil...................................................................................................................27
4.1 Geräte und Materialien.........................................................................................................27
4.2 Präparation von Schimmelpilzsporen...................................................................................27
4.2.1 Gewinnung der Sporen.....................................................................................................27
4.2.2 Sporen-Vorbehandlungen................................................................................................28
4.2.3 Aufschiuss der Sporen.....................................................................................................29
4.3 Allgemeine Nukleinsäuretechniken......................................................................................30
4.3.1 Quantifizierung.................................................................................................................30
4.3.2 Ethanotfälung...................................................................................................................31
VII
Inhaltsverzeichnis
4.3.3 Geleiektrophorese............................................................................................................31
4.3.4 Gelelution..........................................................................................................................33
4.4 Arbeitstechniken im Umgang mit Proteinen.........................................................................33
4.4.1 Proteinbestimmung...........................................................................................................33
4.4.2 Proteinfällung mit Trichloressigsäure (TCA)....................................................................34
4.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese............................................................................34
4.4.4 Anfärben von Proteinen in SDS-PAA-Gelen....................................................................35
4.5 SELEX-Prozess....................................................................................................................35
4.5.1 Prinzip des ssDNA-SELEX-Prozesses.............................................................................35
4.5.2 Oligonukleotid-Bibliothek und Primer...............................................................................36
4.5.3 Targets..............................................................................................................................37
4.5.3.1 Intakte Schimmelpilzsporen......................................................................................37
4.5.3.2 Lösliche Sporenfraktion............................................................................................38
4.5.3.3 Laminarin..................................................................................................................39
4.5.3.4 Ethanolamin..............................................................................................................40
4.5.4 Durchführung des SELEX-Prozesses..............................................................................41
4.6 Klonierung selektierter Aptamer-DNA..................................................................................45
4.6.1 Klonierung selektierter DNA nach der letzten SELEX-Runde..........................................45
4.6.2 Überprüfung der Transformanten mittels Kolonie-PCR....................................................46
4.6.3 Präparation von pDNA......................................................................................................48
4.7 Sequenzanalyse individueller Aptamerklone........................................................................49
4.7.1 Sequenzierung..................................................................................................................49
4.7.2 Sequenz- und Strukturanalyse.........................................................................................49
4.8 Bindungsversuche mit individuellen Aptameren...................................................................50
4.8.1 Bindungsversuche mit immobilisiertem Target.................................................................50
4.8.2 Affinitäts-Elutionen............................................................................................................51
4.8.3 Versuche mit dem lAsys-Affinitätssensor.........................................................................52
4.8.4 Affinitätsreinigung mit Aptameren.....................................................................................55
Ergebnisse..................................................................................................................................56
5.1 Aptamere für Schimmelpilzsporen........................................................................................56
5.1.1 in vitro Selektion zur Gewinnung von Aptameren für Schimmelpilze...............................56
5.1.1.1 Vorbehandelte Sporen als Target.............................................................................56
5.1.1.2 Immobilisiertes ß-Glucan als Target.........................................................................62
5.1.1.3 Lösliche Sporenfraktion als Target...........................................................................67
5.1.2 Sequenzierung und Sequenzanalyse...............................................................................71
5.1.2.1 Einteilung der Sequenzen nach Primärstruktur........................................................71
5.1.2.2 Analyse der Sekundärstrukturen..............................................................................75
5.1.3 Bindungsstudien mit individuellen Aptameren..................................................................78
5.1.3.1 Bindungsstudien mit immobilisierter löslicher Sporenfraktion..................................78
5.1.3.2 Messungen im lAsys-Affinitätssensor.......................................................................80
5.1.3.3 Affirritätsreinigurtg mit Aptameren.............................................................................83
VIII
Inhaltsverzeichnis
5.2 Aptamere für Ethanolamin....................................................................................................85
5.2.1 SELEX zur Gewinnung von Aptameren für Ethanolamin.................................................85
5.2.2 Sequenzierung und Sequenzanalyse...............................................................................88
5.2.2.1 Einteilung der Sequenzen nach Primärstruktur........................................................88
5.2.2.2 Analyse der Sekundärstrukturen..............................................................................93
5.2.3 Bindungsstudien mit individuellen Aptameren.................................................................95
5.2.3.1 Bindungseffizienz der individuellen Aptamerklone...................................................95
5.2.3.2 Bestimmung der Dissoziationskonstanten...............................................................97
5.2.3.3 Affinitätselution zur Bestimmung der Kreuzreaktivität............................................100
6 Diskussion und Ausblick.........................................................,...............................................113
6.1 Selektion von Aptameren für Schimmelpilzbestandteile....................................................113
6.1.1 Seiektionsexperimente für ganze Schimmelpilzsporen..................................................113
6.1.2 Selektionsexperimente für fi-Glucan..............................................................................114
6.1.3 Aptamere für die lösliche Sporenfraktion.......................................................................116
6.1.4 Weiterführende Arbeiten und Anwendungspotenzial.....................................................119
6.2 Selektion von Aptameren für Ethanolamin.........................................................................119
6.2.1 SELEX-Prozess zur Gewinnung der Aptamere.............................................................119
6.2.2 Beurteilung der gewonnenen Aptamersequenzen.........................................................121
6.2.3 Betrachtung der Bindungsversuche...............................................................................123
6.2.4 Weiterführende Arbeiten und Anwendungspotenzial.....................................................129
6.3 Ähnlichkeit von Aptameren aus verschiedenen SELEX-Prozessen..................................130
6.3.1 Vergleich von Aptameren aus SELEX SL1 und SP13...................................................130
6.3.2 Vergleich mit Aptameren aus der Literatur.....................................................................131
6.3.3 Weiterführende Arbeiten und Anwendungspotenzial.....................................................133
7 Zusammenfassung...................................................................................................................134
8 Literaturverzeichnis.................................................................................................................136
Eigene Arbeiten.....................................................................................................................................i
Erklärung...............................................................................................................................................ii
Danksagung.........................................................................................................................................iii
Lebenslauf............................................................................................................................................iv
IX
|
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis.VII
Abkürzungsverzeichnis.X
Abbildungsverzeichnis.XII
Tabellenverzeichnis.XIV
1 Einleitung.1
2 Zielstellung.2
3 Theoretischer Teil.4
3.1 Biosensoren.4
3.1.1 Aufbau und Funktion.4
3.1.2 Transducer.5
3.1.3 Biorezeptoren.7
3.2 Aptamere.8
3.2.1 Struktur und Funktionsweise.8
3.2.2 Eigenschaften von Aptameren.11
3.2.3 Einsatz von Aptameren.12
3.2.4 in vitro Selektion zur Gewinnung von Aptameren.12
3.2.4.1 Prinzip.12
3.2.4.2 SELEX-Varianten.15
3.2.4.3 RuMag-SELEX.16
3.3 Verwendete Targets für die Aptamergewinnung.17
3.3.1 Schimmelpilzsporen.17
3.3.1.1 Schimmelpilze.17
3.3.1.2 Etablierte Nachweismethoden.19
3.3.1.3 Konidien und deren Bestandteile als Targets im SELEX-Prozess.20
3.3.2 Ethanolamin.23
4 Experimenteller Teil.27
4.1 Geräte und Materialien.27
4.2 Präparation von Schimmelpilzsporen.27
4.2.1 Gewinnung der Sporen.27
4.2.2 Sporen-Vorbehandlungen.28
4.2.3 Aufschiuss der Sporen.29
4.3 Allgemeine Nukleinsäuretechniken.30
4.3.1 Quantifizierung.30
4.3.2 Ethanotfälung.31
VII
Inhaltsverzeichnis
4.3.3 Geleiektrophorese.31
4.3.4 Gelelution.33
4.4 Arbeitstechniken im Umgang mit Proteinen.33
4.4.1 Proteinbestimmung.33
4.4.2 Proteinfällung mit Trichloressigsäure (TCA).34
4.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.34
4.4.4 Anfärben von Proteinen in SDS-PAA-Gelen.35
4.5 SELEX-Prozess.35
4.5.1 Prinzip des ssDNA-SELEX-Prozesses.35
4.5.2 Oligonukleotid-Bibliothek und Primer.36
4.5.3 Targets.37
4.5.3.1 Intakte Schimmelpilzsporen.37
4.5.3.2 Lösliche Sporenfraktion.38
4.5.3.3 Laminarin.39
4.5.3.4 Ethanolamin.40
4.5.4 Durchführung des SELEX-Prozesses.41
4.6 Klonierung selektierter Aptamer-DNA.45
4.6.1 Klonierung selektierter DNA nach der letzten SELEX-Runde.45
4.6.2 Überprüfung der Transformanten mittels Kolonie-PCR.46
4.6.3 Präparation von pDNA.48
4.7 Sequenzanalyse individueller Aptamerklone.49
4.7.1 Sequenzierung.49
4.7.2 Sequenz- und Strukturanalyse.49
4.8 Bindungsversuche mit individuellen Aptameren.50
4.8.1 Bindungsversuche mit immobilisiertem Target.50
4.8.2 Affinitäts-Elutionen.51
4.8.3 Versuche mit dem lAsys-Affinitätssensor.52
4.8.4 Affinitätsreinigung mit Aptameren.55
Ergebnisse.56
5.1 Aptamere für Schimmelpilzsporen.56
5.1.1 in vitro Selektion zur Gewinnung von Aptameren für Schimmelpilze.56
5.1.1.1 Vorbehandelte Sporen als Target.56
5.1.1.2 Immobilisiertes ß-Glucan als Target.62
5.1.1.3 Lösliche Sporenfraktion als Target.67
5.1.2 Sequenzierung und Sequenzanalyse.71
5.1.2.1 Einteilung der Sequenzen nach Primärstruktur.71
5.1.2.2 Analyse der Sekundärstrukturen.75
5.1.3 Bindungsstudien mit individuellen Aptameren.78
5.1.3.1 Bindungsstudien mit immobilisierter löslicher Sporenfraktion.78
5.1.3.2 Messungen im lAsys-Affinitätssensor.80
5.1.3.3 Affirritätsreinigurtg mit Aptameren.83
VIII
Inhaltsverzeichnis
5.2 Aptamere für Ethanolamin.85
5.2.1 SELEX zur Gewinnung von Aptameren für Ethanolamin.85
5.2.2 Sequenzierung und Sequenzanalyse.88
5.2.2.1 Einteilung der Sequenzen nach Primärstruktur.88
5.2.2.2 Analyse der Sekundärstrukturen.93
5.2.3 Bindungsstudien mit individuellen Aptameren.95
5.2.3.1 Bindungseffizienz der individuellen Aptamerklone.95
5.2.3.2 Bestimmung der Dissoziationskonstanten.97
5.2.3.3 Affinitätselution zur Bestimmung der Kreuzreaktivität.100
6 Diskussion und Ausblick.,.113
6.1 Selektion von Aptameren für Schimmelpilzbestandteile.113
6.1.1 Seiektionsexperimente für ganze Schimmelpilzsporen.113
6.1.2 Selektionsexperimente für fi-Glucan.114
6.1.3 Aptamere für die lösliche Sporenfraktion.116
6.1.4 Weiterführende Arbeiten und Anwendungspotenzial.119
6.2 Selektion von Aptameren für Ethanolamin.119
6.2.1 SELEX-Prozess zur Gewinnung der Aptamere.119
6.2.2 Beurteilung der gewonnenen Aptamersequenzen.121
6.2.3 Betrachtung der Bindungsversuche.123
6.2.4 Weiterführende Arbeiten und Anwendungspotenzial.129
6.3 Ähnlichkeit von Aptameren aus verschiedenen SELEX-Prozessen.130
6.3.1 Vergleich von Aptameren aus SELEX SL1 und SP13.130
6.3.2 Vergleich mit Aptameren aus der Literatur.131
6.3.3 Weiterführende Arbeiten und Anwendungspotenzial.133
7 Zusammenfassung.134
8 Literaturverzeichnis.136
Eigene Arbeiten.i
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Danksagung.iii
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