Untersuchungen zur Aggregation und Aktivität von Mitochondrien im Ooplasma von Cumulus-Oozyten-Komplexen des Rindes während der In-vitro-Reifung:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
Mensch-&-Buch-Verl.
2007
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Nebentitel: Aggregation and activity of mitochondria during in vitro maturation of cattle oocytes |
| Beschreibung: | II, 185 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis 1
Abbildungsverzeichnis 3
Tabellenverzeichnis 5
1. Einleitung 7
2. Literatur 9
2.1. Follikulogenese und Oogenese 9
2.1.1. Follikulogenese 9
2.1.2. Oogenese 12
2.1.3. Oozytenreifung 13
2.2. Ultrastrukturelle Vongänge während der Maturation 18
2.3. Mitochondrien 30
2.3.1. Bedeutung der Mitochondrien im zellulären Stoffwechsel 30
2.3.2. Mitochondrien und ihre Funktion in Oozyten 33
2.4. Apoptose 42
2.4.1. Bedeutung der Apoptose während Follikelentwicklung und Oogenese 43
2.4.2. Die Bedeutung der Mitochondrien im apoptotischen Geschehen 44
2.4.3. Caspasen 47
2.5. In-vitro Maturation von Rinderembryonen 49
2.5.1. Gewinnung und Klassifizierung von Cumulus-Oozyten-Komplexen (COK)
für die IVM 49
2.5.2. In-vitro Maturation von bovinen Oozyten 52
3. Material und Methoden SS
3.1. Untersuchungsmaterial und Versuchsaufteilung 55
3.2. Spendertiere 56
3.3. Entnahme der Ovarien 56
3.4. Gewinnung und Klassifizierung der Cumulus-Oozyten- Komplexe (COK) 57
3.5. In-vitro-Reifung (IVM) der Cumulus-Oozyten-Komplexe 58
3.6. Beurteilung der Chromatfrikonfiguration in den Oozyten und Bestimmung der
Aktivität und Verteilung von Mitochondrien im Ooplasma 59
3.6.1. Anfärbung der Mitochondrien zur Bestimmung der Verteilung und Aktivität im
Ooplasma 59
3.6.2. Anfärbung des Chromatin 63
3.7. Beurteilung des Apoptoseverlaufes in Cumuluszellen wahrend der In-vitro-Reifung 64
3.7.1. Entfernung der Cumuluszellen nach der Reifung und Herstellung der
Präparate zur Apoptosebestimmung 64
I
Inhaltsverzeichnis
3.7.2. Nachweis von Apoptose in Cumuluszellen durch Markierung von DNA-
Strangbrüchen mit TdT (TUNEL) 65
3.7.3. Fluoreszenzmikroskopische Auswertung 66
3.8. Caspase-Bestimmung im Ooplasma und in den Cumuluszellen 67
3.9. Einschätzung der Entwicklungsfähigkeit der einzelnen COK-Klassen 71
3.9.1. In-vitro-Fertilisation (IVF) 71
3.10. Statistische Auswertungen 72
4. Ergebnisse 73
4.1. Untersuchungen zu nuklearen Veränderungen in bovinen Oozyten
während der IVM 73
4.1.1. Chromatinkonfiguration in Abhängigkeit von der Maturationszeit 73
4.1.2. Chromatinkonfiguration in Abhängigkeit von der Maturationszeit und der
Cumulusmorphologie 76
4.2. Untersuchung zu den mitochondrialen Veränderungen in bovinen Oozyten während
der IVM 84
4.2.1. Untersuchung zur mitochondrialen Aggregation im Ooplasma boviner Oozyten 84
4.2.2. Mitochondriale Intensität 91
4.3. Untersuchungen zu apoptotischen Veränderungen 98
4.4. Untersuchung zur Entwicklungskompetenz von Oozyten 105
5. Diskussion 109
5.1. Untersuchungen zu nuklearen Veränderungen 109
5.2. Untersuchungen zu mitochondrialen Veränderungen 112
5.2.1. Untersuchungen zur mitochondrialen Aggregation 113
5.2.2. Untersuchungen zur mitochondrialen Aktivität 116
5.3. Untersuchungen zu apoptotischen Veränderungen 119
5.4. Beziehung zwischen mitochondrialen Parametern und Parametern der Apoptose 122
5.5. Zuordnung der untersuchten Qualitätsparametem zur Entwicklungskompetenz von
bovinen Oozyten 123
6. Zusammenfassung 128
7. Summary 131
8. Anhang 133
9. Literaturverzeichnis 140
Danksagung 181
Lebenslauf 183
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Versuchsabschnitte 56
Abb. 2 COK-Klassen 58
Abb. 3 Versuchsschema Chromatinkonfiguration/Aggregation und Aktivität der
Mitochondrien 62
Abb. 4 Schema der Probenbearbeitung für die Caspase-3-Bestimmung 69
Abb. 5 Chromatinkonfigurationen 75
Abb. 6 Denudierte Oozyte der COK-Klasse I mit Polkörper nach
24 h IVM 77
Abb. 7 Häufigkeit der verschiedenen Chromatinkonfigurationen bei
Oozyten (n=232) der verschiedenen COK-Klassen zum Zeitpunkt ti 83
Abb. 8 Häufigkeit der verschiedenen Chromatinkonfigurationen bei
Oozyten (n=201) der verschiedenen COK-Klassen zum Zeitpunkt t12 84
Abb. 9 Häufigkeit der verschiedenen Chromatinkonfigurationen bei
Oozyten (n=164) der verschiedenen COK-Klassen zum Zeitpunkt t2o 84
Abb. 10 Häufigkeit der verschiedenen Chromatinkonfigurationen bei
Oozyten (n=219) der verschiedenen COK-Klassen zum Zeitpunkt t2t 85
Abb. 11 Mitochondriale Aggregationsmuster 86
Abb. 12 Prozentuale Häufigkeit der mitochondrialen Aggregation in
Abhängigkeit von der Chromatinkonfiguration 92
Abb. 13 Mitochondriale Fluoreszenzintensität
in bovinen Oozyten während der IVM 93
Abb. 14 Mitochondriale Fluoreszenzintensität in bovinen Oozyten
in Abhängigkeit von der verwendeten COK-Klasse 94
Abb. 15 Mittelwerte der mitochondrialen Aktivität im Verlauf der IVM
in Abhängigkeit von der COK-Klasse 95
Abb. 16 Mitochondriale Fluoreszenzintensität (uA/Oozyte) im Vertauf der IVM
in Abhängigkeit von dem mitochondrialen Aggregationsmuster 98
Abb. 17 Mitochondriale Fluoreszenzintensität (Intensität in uA/Oozyte)
in Abhängigkeit von der Chromatinkonfiguration 99
Abb. 18 Apoptoseverlauf bei Cumuluszellen boviner COK wahrend der IVM 101
Abb. 19 Anteil apoptotischer Cumuluszellen in drei verschiedenen COK-Klassen 101
Abb. 20 Apoptoseindex (LSM-Werte in %) in Cumuluszellkemen der
verschiedenen COK-Klassen zu den Zeitpunkten to, t,2 und t24 der IVM 102
Abb. 21 Apoptose in Cumuluszellen der COK-Klasse III nach 12 h IVM 103
Abbildungsverzeichnis
Abb. 22 Ergebnisse des Nachweises von Caspase-3 und cleaved-Caspase-3
zum Zeitpunkt t,2 der IVM in Oozyten und Cumuluszellen 105
Abb. 23 Ergebnisse zum Nachweis von Aktin, Caspase-3
und cleaved-Caspase-3 zu den Zeitpunkten tOl t12 und t24 in
intakten Cumulus-Oozyten-Komplexen 105
Abb. 24 Furchungsrate (LSM in %) am Tag 3 p.fert.
in Abhängigkeit von der verwendeten COK-Klasse 106
Abb. 25 Verschiedene Stadien boviner Blastozysten 109
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tab.1 Terminierung des GVBD bei verschiedenen Spezies
(nach EPPIG 1993) 19
Tab. 2 Funktionen der MAPK im meiotischen Zellzyklus beim Säugetier
(mod. nach Sun, Fan 2004) 22
Tab. 3 Einfluss der Cumuluszellen auf die Oozyte 27
Tab. 4 Einfluss der Oozyte auf die Cumuluszellen 28
Tab. S Möglichkeiten der Beeinflussung der Apoptose durch Mitochondrien 45
Tab. 6 Einteilung von Caspasen 48
Tab. 7 Einteilung von Caspasen nach ihrer bevorzugten Spaltungsstelle
(FISCHER et al. 2003) 49
Tab. 8 Klassifizierungsschema für Ooryten nach HAWK und WALL (1994) 52
Tab. 9 Klassifizierungsschema für Oozyten nach TORNER et al. (2003) 53
Tab. 10 Klassifizierung der Cumulus-Oozyten-Komplexe 58
Tab. 11. Häufigkeit der verschiedenen Kemstadien im Verlauf der IVM 76
Tab. 12 Häufigkeit der verschiedenen Kemstadien in Oozyten
der COK-Klasse lim Verlauf der IVM 78
Tab. 13 Häufigkeit der verschiedenen Kemstadien in Oozyten
der COK-Klasse II im Verlauf der IVM 80
Tab. 14 Häufigkeit der verschiedenen Kernstadien in Oozyten
der COK-Klasse III im Verlauf der IVM 81
Tab. 15 Häufigkeit der verschiedenen Kemstadien in COK der Klasse IV
im Verlauf der IVM 82
Tab. 16 Aggregationsmuster der Mitochondrien in den Oozyten
(x ± SEM in %) im Verlauf der IVM 87
Tab. 17 Mitochondriale Aggregation in Oozyten (n=1450) in verschiedenen
COK-Klassen (x ± SEM in %) 88
Tab. 18 Prozentuale Häufigkeit der grobkörnigen mitochondrialen Aggregation
in Oozyten (n= 172) der verschiedenen COK-Klassen im Verlauf der IVM 89
Tab. 19 Prozentuale Häufigkeit der kristallinen mitochondrialen Aggregation in
Oozyten (n=304) der verschiedenen COK-Klassen im Verlauf der IVM 90
Tab. 20 Prozentuale Häufigkeit der feinkörnigen mitochondrialen Aggregation in
Oozyten (n=974) der verschiedenen COK-Klassen im Verlauf der IVM 91
Tab. 21 Mittelwerte der mitochondrialen Fluoreszenzintensität bei bovinen
Oozyten mit verschiedenen mitochondrialen Aggregationsformen 96
Tab. 22 Mitochondriale Intensität bei Oozyten verschiedener COK-Klassen
in Abhängigkeit vom mitochondriaten Aggregationsmuster 97
Tabellenverzeichnis
Tab. 23 Anteil apoptotischer Cumuluszellen bei bovinen COK während der IVM 100
Tab. 24 Blastozystenrate (LSM-Werte in %)
bezogen auf die Anzahl an verwendeten COK 107
Tab. 25 Blastozystenrate (LSM-Werte in %)
bezogen auf die Gesamtzahl der gefurchten Embryonen 108
|
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis 1
Abbildungsverzeichnis 3
Tabellenverzeichnis 5
1. Einleitung 7
2. Literatur 9
2.1. Follikulogenese und Oogenese 9
2.1.1. Follikulogenese 9
2.1.2. Oogenese 12
2.1.3. Oozytenreifung 13
2.2. Ultrastrukturelle Vongänge während der Maturation 18
2.3. Mitochondrien 30
2.3.1. Bedeutung der Mitochondrien im zellulären Stoffwechsel 30
2.3.2. Mitochondrien und ihre Funktion in Oozyten 33
2.4. Apoptose 42
2.4.1. Bedeutung der Apoptose während Follikelentwicklung und Oogenese 43
2.4.2. Die Bedeutung der Mitochondrien im apoptotischen Geschehen 44
2.4.3. Caspasen 47
2.5. In-vitro Maturation von Rinderembryonen 49
2.5.1. Gewinnung und Klassifizierung von Cumulus-Oozyten-Komplexen (COK)
für die IVM 49
2.5.2. In-vitro Maturation von bovinen Oozyten 52
3. Material und Methoden SS
3.1. Untersuchungsmaterial und Versuchsaufteilung 55
3.2. Spendertiere 56
3.3. Entnahme der Ovarien 56
3.4. Gewinnung und Klassifizierung der Cumulus-Oozyten- Komplexe (COK) 57
3.5. In-vitro-Reifung (IVM) der Cumulus-Oozyten-Komplexe 58
3.6. Beurteilung der Chromatfrikonfiguration in den Oozyten und Bestimmung der
Aktivität und Verteilung von Mitochondrien im Ooplasma 59
3.6.1. Anfärbung der Mitochondrien zur Bestimmung der Verteilung und Aktivität im
Ooplasma 59
3.6.2. Anfärbung des Chromatin 63
3.7. Beurteilung des Apoptoseverlaufes in Cumuluszellen wahrend der In-vitro-Reifung 64
3.7.1. Entfernung der Cumuluszellen nach der Reifung und Herstellung der
Präparate zur Apoptosebestimmung 64
I
Inhaltsverzeichnis
3.7.2. Nachweis von Apoptose in Cumuluszellen durch Markierung von DNA-
Strangbrüchen mit TdT (TUNEL) 65
3.7.3. Fluoreszenzmikroskopische Auswertung 66
3.8. Caspase-Bestimmung im Ooplasma und in den Cumuluszellen 67
3.9. Einschätzung der Entwicklungsfähigkeit der einzelnen COK-Klassen 71
3.9.1. In-vitro-Fertilisation (IVF) 71
3.10. Statistische Auswertungen 72
4. Ergebnisse 73
4.1. Untersuchungen zu nuklearen Veränderungen in bovinen Oozyten
während der IVM 73
4.1.1. Chromatinkonfiguration in Abhängigkeit von der Maturationszeit 73
4.1.2. Chromatinkonfiguration in Abhängigkeit von der Maturationszeit und der
Cumulusmorphologie 76
4.2. Untersuchung zu den mitochondrialen Veränderungen in bovinen Oozyten während
der IVM 84
4.2.1. Untersuchung zur mitochondrialen Aggregation im Ooplasma boviner Oozyten 84
4.2.2. Mitochondriale Intensität 91
4.3. Untersuchungen zu apoptotischen Veränderungen 98
4.4. Untersuchung zur Entwicklungskompetenz von Oozyten 105
5. Diskussion 109
5.1. Untersuchungen zu nuklearen Veränderungen 109
5.2. Untersuchungen zu mitochondrialen Veränderungen 112
5.2.1. Untersuchungen zur mitochondrialen Aggregation 113
5.2.2. Untersuchungen zur mitochondrialen Aktivität 116
5.3. Untersuchungen zu apoptotischen Veränderungen 119
5.4. Beziehung zwischen mitochondrialen Parametern und Parametern der Apoptose 122
5.5. Zuordnung der untersuchten Qualitätsparametem zur Entwicklungskompetenz von
bovinen Oozyten 123
6. Zusammenfassung 128
7. Summary 131
8. Anhang 133
9. Literaturverzeichnis 140
Danksagung 181
Lebenslauf 183
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Versuchsabschnitte 56
Abb. 2 COK-Klassen 58
Abb. 3 Versuchsschema Chromatinkonfiguration/Aggregation und Aktivität der
Mitochondrien 62
Abb. 4 Schema der Probenbearbeitung für die Caspase-3-Bestimmung 69
Abb. 5 Chromatinkonfigurationen 75
Abb. 6 Denudierte Oozyte der COK-Klasse I mit Polkörper nach
24 h IVM 77
Abb. 7 Häufigkeit der verschiedenen Chromatinkonfigurationen bei
Oozyten (n=232) der verschiedenen COK-Klassen zum Zeitpunkt ti 83
Abb. 8 Häufigkeit der verschiedenen Chromatinkonfigurationen bei
Oozyten (n=201) der verschiedenen COK-Klassen zum Zeitpunkt t12 84
Abb. 9 Häufigkeit der verschiedenen Chromatinkonfigurationen bei
Oozyten (n=164) der verschiedenen COK-Klassen zum Zeitpunkt t2o 84
Abb. 10 Häufigkeit der verschiedenen Chromatinkonfigurationen bei
Oozyten (n=219) der verschiedenen COK-Klassen zum Zeitpunkt t2t 85
Abb. 11 Mitochondriale Aggregationsmuster 86
Abb. 12 Prozentuale Häufigkeit der mitochondrialen Aggregation in
Abhängigkeit von der Chromatinkonfiguration 92
Abb. 13 Mitochondriale Fluoreszenzintensität
in bovinen Oozyten während der IVM 93
Abb. 14 Mitochondriale Fluoreszenzintensität in bovinen Oozyten
in Abhängigkeit von der verwendeten COK-Klasse 94
Abb. 15 Mittelwerte der mitochondrialen Aktivität im Verlauf der IVM
in Abhängigkeit von der COK-Klasse 95
Abb. 16 Mitochondriale Fluoreszenzintensität (uA/Oozyte) im Vertauf der IVM
in Abhängigkeit von dem mitochondrialen Aggregationsmuster 98
Abb. 17 Mitochondriale Fluoreszenzintensität (Intensität in uA/Oozyte)
in Abhängigkeit von der Chromatinkonfiguration 99
Abb. 18 Apoptoseverlauf bei Cumuluszellen boviner COK wahrend der IVM 101
Abb. 19 Anteil apoptotischer Cumuluszellen in drei verschiedenen COK-Klassen 101
Abb. 20 Apoptoseindex (LSM-Werte in %) in Cumuluszellkemen der
verschiedenen COK-Klassen zu den Zeitpunkten to, t,2 und t24 der IVM 102
Abb. 21 Apoptose in Cumuluszellen der COK-Klasse III nach 12 h IVM 103
Abbildungsverzeichnis
Abb. 22 Ergebnisse des Nachweises von Caspase-3 und cleaved-Caspase-3
zum Zeitpunkt t,2 der IVM in Oozyten und Cumuluszellen 105
Abb. 23 Ergebnisse zum Nachweis von Aktin, Caspase-3
und cleaved-Caspase-3 zu den Zeitpunkten tOl t12 und t24 in
intakten Cumulus-Oozyten-Komplexen 105
Abb. 24 Furchungsrate (LSM in %) am Tag 3 p.fert.
in Abhängigkeit von der verwendeten COK-Klasse 106
Abb. 25 Verschiedene Stadien boviner Blastozysten 109
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tab.1 Terminierung des GVBD bei verschiedenen Spezies
(nach EPPIG 1993) 19
Tab. 2 Funktionen der MAPK im meiotischen Zellzyklus beim Säugetier
(mod. nach Sun, Fan 2004) 22
Tab. 3 Einfluss der Cumuluszellen auf die Oozyte 27
Tab. 4 Einfluss der Oozyte auf die Cumuluszellen 28
Tab. S Möglichkeiten der Beeinflussung der Apoptose durch Mitochondrien 45
Tab. 6 Einteilung von Caspasen 48
Tab. 7 Einteilung von Caspasen nach ihrer bevorzugten Spaltungsstelle
(FISCHER et al. 2003) 49
Tab. 8 Klassifizierungsschema für Ooryten nach HAWK und WALL (1994) 52
Tab. 9 Klassifizierungsschema für Oozyten nach TORNER et al. (2003) 53
Tab. 10 Klassifizierung der Cumulus-Oozyten-Komplexe 58
Tab. 11. Häufigkeit der verschiedenen Kemstadien im Verlauf der IVM 76
Tab. 12 Häufigkeit der verschiedenen Kemstadien in Oozyten
der COK-Klasse lim Verlauf der IVM 78
Tab. 13 Häufigkeit der verschiedenen Kemstadien in Oozyten
der COK-Klasse II im Verlauf der IVM 80
Tab. 14 Häufigkeit der verschiedenen Kernstadien in Oozyten
der COK-Klasse III im Verlauf der IVM 81
Tab. 15 Häufigkeit der verschiedenen Kemstadien in COK der Klasse IV
im Verlauf der IVM 82
Tab. 16 Aggregationsmuster der Mitochondrien in den Oozyten
(x ± SEM in %) im Verlauf der IVM 87
Tab. 17 Mitochondriale Aggregation in Oozyten (n=1450) in verschiedenen
COK-Klassen (x ± SEM in %) 88
Tab. 18 Prozentuale Häufigkeit der grobkörnigen mitochondrialen Aggregation
in Oozyten (n= 172) der verschiedenen COK-Klassen im Verlauf der IVM 89
Tab. 19 Prozentuale Häufigkeit der kristallinen mitochondrialen Aggregation in
Oozyten (n=304) der verschiedenen COK-Klassen im Verlauf der IVM 90
Tab. 20 Prozentuale Häufigkeit der feinkörnigen mitochondrialen Aggregation in
Oozyten (n=974) der verschiedenen COK-Klassen im Verlauf der IVM 91
Tab. 21 Mittelwerte der mitochondrialen Fluoreszenzintensität bei bovinen
Oozyten mit verschiedenen mitochondrialen Aggregationsformen 96
Tab. 22 Mitochondriale Intensität bei Oozyten verschiedener COK-Klassen
in Abhängigkeit vom mitochondriaten Aggregationsmuster 97
Tabellenverzeichnis
Tab. 23 Anteil apoptotischer Cumuluszellen bei bovinen COK während der IVM 100
Tab. 24 Blastozystenrate (LSM-Werte in %)
bezogen auf die Anzahl an verwendeten COK 107
Tab. 25 Blastozystenrate (LSM-Werte in %)
bezogen auf die Gesamtzahl der gefurchten Embryonen 108 |
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