Molekularbiologische Diagnostik systemischer Infektionen durch Candida spp. mittels LightCycler-PCR:
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| Format: | Buch |
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2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Cand/da Infektionen beim Menschen 5
2.1 Taxonomie 5
2.2 Bedeutung und Verbreitung klinisch relevanter Candida spp 5
2.2.1 Candida glabrata 5
2.2.2 Candida parapsilosis 6
2.2.3 Candida tropicalis 6
2.2.4 Candida lusitaniae 6
2.2.5 Candida dubliniensis 6
2.2.6 Saccharomyces cerevisiae 7
2.3 Eigenschaften der Sprosspilze 7
2.4 Virulenzfaktoren und Pathogenese der invasiven Candidose 10
3 Therapie der systemischen Cand/da Infektion 13
4 Diagnostik von Candidosen 16
4.1 Mikroskopie, Kultur und biochemische Differenzierung 16
4.2 Antigennachweise 17
4.3 Antikörpernachweise 19
4.4 Nachweis von Cand/da spezifischen Stoffwechselprodukten 20
4.5 Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäure 20
4.6 Zusammenfassung 25
5 Aufgabenstellung 26
6 Patienten, Material und Methoden 27
6.1 Patienten 27
6.2 Material 30
6.2.1 Geräte 30
6.2.2 Nukleinsäurepräparation 30
6.2.3 Nukleinsäureamplifikation 31
6.2.4 Gelelektrophorese 32
6.2.5 Einwegmaterialien 32
6.2.6 Spezieshaltung und Kultivierung 32
6.2.7 Pilzkulturen 33
6.2.8 Bestimmung des Mannan Antigens durch ELISA
und biochemische Identifizierung 33
I
6.2.9 Pufferlösungen für die DNA Präparation aus EDTA Blutproben 33
6.3 Methoden 35
6.3.1 DNA Präparation 35
6.3.2 Ultraspektrophotometrische Bestimmung
der Nukleinsäurekonzentration 37
6.3.3 Amplifikation der präparierten Nukleinsäure 37
6.3.3.1 konventionelle PCR 37
6.3.3.2 Nachweis der Amplifikate in der Gelelektrophorese 38
6.3.3.3 LightCycler® PCR und Entwicklung neuer BFF Sonden
(„hybridisation probes ) 39
6.3.4 Herstellung von Standards für die LightCycler® PCR 40
6.3.5 Sequenzierung des 18S rRNA Gens
von Candida albicans ATCC 2091 41
6.3.6 Herleitung der Standardkurve und Sensitivitätsbestimmung
der LightCycler® PCR 42
6.3.7 Nachweis von Candida albicans
durch den Platelia® Cancfc/a Ag ELISA 43
6.3.8 Identifikation von Candida Spezies durch den API® ID 32C 44
6.3.9 Prüfung der Kreuzreaktivität der verwendeten BFF Sonden
im LightCycler® 44
6.3.10 Nukleinsäurepräparation aus Patientenmaterialien
für Candida albicans 45
6.3.10.1 DNA Präparation aus Trachealsekreten, Serum und
Urinproben 45
6.3.10.2 Vergleich der LightCycler® PCR
mit dem Platelia® Cand/cte Ag ELISA 46
6.3.10.3 DNA Präparation aus EDTA Blutproben 47
6.3.11 Verwendung von Inhibitionskontrollen 49
7 Ergebnisse 51
7.1 Nukleinsäurepräparation und Nachweisgrenze in
Patientenmaterialien 51
7.2 Durchführung der LightCycler® PCR 62
7.2.1 Sensitivitätsbestimmung anhand von Standardproben und
Erstellen der Standardkurve 62
II
7.2.1.1 Sequenzanalyse des Genfragmentes
aus Standardproben 63
7.2.2 Unterscheidung von Candida spp. durch Schmelzkurvenanalyse 64
7.2.3 Überprüfung der Kreuzreaktivität der LightCycler® PCR
mit Aspergillus spp 67
7.2.4 Kostenanalyse für die LightCycler® PCR 68
7.3 Durchführung der konventionellen PCR 69
7.4 Ergebnisse der Patientenuntersuchungen 70
8 Diskussion 80
9 Zusammenfassung 92
Anhang
Literaturverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Fragebogen
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Lebenslauf
Danksagung
III
|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Cand/da Infektionen beim Menschen 5
2.1 Taxonomie 5
2.2 Bedeutung und Verbreitung klinisch relevanter Candida spp 5
2.2.1 Candida glabrata 5
2.2.2 Candida parapsilosis 6
2.2.3 Candida tropicalis 6
2.2.4 Candida lusitaniae 6
2.2.5 Candida dubliniensis 6
2.2.6 Saccharomyces cerevisiae 7
2.3 Eigenschaften der Sprosspilze 7
2.4 Virulenzfaktoren und Pathogenese der invasiven Candidose 10
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4 Diagnostik von Candidosen 16
4.1 Mikroskopie, Kultur und biochemische Differenzierung 16
4.2 Antigennachweise 17
4.3 Antikörpernachweise 19
4.4 Nachweis von Cand/da spezifischen Stoffwechselprodukten 20
4.5 Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäure 20
4.6 Zusammenfassung 25
5 Aufgabenstellung 26
6 Patienten, Material und Methoden 27
6.1 Patienten 27
6.2 Material 30
6.2.1 Geräte 30
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6.2.3 Nukleinsäureamplifikation 31
6.2.4 Gelelektrophorese 32
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6.2.6 Spezieshaltung und Kultivierung 32
6.2.7 Pilzkulturen 33
6.2.8 Bestimmung des Mannan Antigens durch ELISA
und biochemische Identifizierung 33
I
6.2.9 Pufferlösungen für die DNA Präparation aus EDTA Blutproben 33
6.3 Methoden 35
6.3.1 DNA Präparation 35
6.3.2 Ultraspektrophotometrische Bestimmung
der Nukleinsäurekonzentration 37
6.3.3 Amplifikation der präparierten Nukleinsäure 37
6.3.3.1 konventionelle PCR 37
6.3.3.2 Nachweis der Amplifikate in der Gelelektrophorese 38
6.3.3.3 LightCycler® PCR und Entwicklung neuer BFF Sonden
(„hybridisation probes") 39
6.3.4 Herstellung von Standards für die LightCycler® PCR 40
6.3.5 Sequenzierung des 18S rRNA Gens
von Candida albicans ATCC 2091 41
6.3.6 Herleitung der Standardkurve und Sensitivitätsbestimmung
der LightCycler® PCR 42
6.3.7 Nachweis von Candida albicans
durch den Platelia® Cancfc/a Ag ELISA 43
6.3.8 Identifikation von Candida Spezies durch den API® ID 32C 44
6.3.9 Prüfung der Kreuzreaktivität der verwendeten BFF Sonden
im LightCycler® 44
6.3.10 Nukleinsäurepräparation aus Patientenmaterialien
für Candida albicans 45
6.3.10.1 DNA Präparation aus Trachealsekreten, Serum und
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6.3.10.2 Vergleich der LightCycler® PCR
mit dem Platelia® Cand/cte Ag ELISA 46
6.3.10.3 DNA Präparation aus EDTA Blutproben 47
6.3.11 Verwendung von Inhibitionskontrollen 49
7 Ergebnisse 51
7.1 Nukleinsäurepräparation und Nachweisgrenze in
Patientenmaterialien 51
7.2 Durchführung der LightCycler® PCR 62
7.2.1 Sensitivitätsbestimmung anhand von Standardproben und
Erstellen der Standardkurve 62
II
7.2.1.1 Sequenzanalyse des Genfragmentes
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7.2.2 Unterscheidung von Candida spp. durch Schmelzkurvenanalyse 64
7.2.3 Überprüfung der Kreuzreaktivität der LightCycler® PCR
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7.2.4 Kostenanalyse für die LightCycler® PCR 68
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7.4 Ergebnisse der Patientenuntersuchungen 70
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III |
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