Molekulargenetische Untersuchung des SRY-Gens bei gonadaler Dysgenesie:
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2007
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 4
1.1. Grundlagen der Geschlechtsdifferenzierung 4
1.1.1. Embryologie der Geschlechtsdifferenzierung 4
1.1.2. Genetische Faktoren der Geschlechtsdifferenzierung 5
1.2. Krankheitsbilder, welche zu Störungen der sexuellen Differenzierung führen können 7
1.2.1. Das Krankheitsbild der reinen gonadalen Dysgenesie 7
1.2.2. Andere Ursachen sexueller Differenzierungsstörungen 10
1.3. Diagnostische Vorgehensweise bei Störungen der Geschlechtsdifferenzierung 13
1.4. Zielstellung : 16
2. MATERIAL 17
2.1. Patienten 17
2.2. DNA 17
2.3. Geräte 17
2.4. Chemikalien 19
2.4.1. Reagenzien, Pufferund Stammlösungen 19
2.4.2. Standards und Farbstoffe 20
2.4.3. Enzyme 21
2.4.4. Kits 21
2.5. Primer 21
3. METHODEN 22
3.1. DNA Isolierung aus Vollblut 22
3.2. Qualitative und quantitative Bestimmung der DNA 23
3.3. Verfielfältigung der DNA Fragmente durch Polymerasekettenreaktion 23
3.3.1. Bestimmung der PCR Parameter 24
3.3.2. Reaktionsansatz und PCR Programm 25
3.4. Visualisierung der PCR Produkte durch Agarose Gelelektrophorese 26
3.5. Aufreinigung der PCR Produkte 27
3.6. Analyse der DNA Fragmente durch direkte DNA Sequenzierung 27
3.6.1. Bestimmung des Reaktionsansatzes und Sequenzierprogramms 28
3.6.2. Fällung der sequenzierten DNA Proben 29
1
3.6.3. Elektrophoretische Auftrennung und Detektion der Sequenzierprodukte im ABI
PRISM™ 377 DNA Sequenzierautomaten 30
3.6.4. Auswertung der Sequenzierungsergebnisse 31
3.7. Analyse der DNA mittels der denaturierenden Hochdruck Flüssigkeits Chromatographie
(DHPLC) 32
3.7.1. Durchfuhrung der DHPLC mittels des WAVE® Nucleic Fragment Analysis Systems 32
3.7.2. Chromatographische Auftrennung von Wildtyp und mutierter DNA mittels der
temperaturmodulierenden Heteroduplexanalyse 33
3.7.3. Durchfuhrung der DNA Analyse mit dem WAVE® System 34
3.7.4. Mutationsdetektion durch chromatographische Darstellung von Homo und
Heteroduplices 36
3.8. Retrospektive Erhebung der Patientendaten mittels eines hierfür erstellten Fragebogens 37
4. ERGEBNISSE 40
4.1. Etablierung der Polymerasekettenreaktion für die drei Fragmente des SRY Gens 40
4.2. Reinigung der PCR Produkte 42
4.3. Etablierung der Direktsequenzierung für den vollständigen DNA Abschnitt des SRY
Gens 43
4.4. Ergebnisse der Direktsequenzierung der SRY Region 43
4.5. Etabilierlung der DHPLC Analyse als Vorscreeningverfahren zur Mutationsdetektion der
DNA 44
4.5.1. Erstellung eines DHPLC Protokolls für jedes der drei Fragmente des SRY Gens 44
4.5.2. Bestimmung des optimalen Schmelzpunktes für die zu untersuchende DNA 44
4.5.3. Ermittlung des Fließmittelgradienten 46
4.6. Ergebnisse der Mutationsanalyse der mittels DHPLC Analyse untersuchten DNA 46
4.7. Auswertung der retrospektiv erhobenen Patientendaten 47
5. DISKUSSION 57
5.1.Methodenetablierung 57
5.2. Patienten mit dem Krankheitsbild der reinen gonadalen Dysgenesie 59
5.2.1. Die Bedeutung der SRY Region bei der Entstehung der reinen gonadalen Dysgenesie59
5.2.2. Die Bedeutung anderer Gene bei der Entstehung der reinen gonadalen Dysgenesie .... 61
5.3. Patienten mit anderen Krankheitsbildern als Ursache der sexuellen
Differenzierungsstörung 66
2
5.4. Richtlinien für die diagnostische Vorgehensweise bei Störungen der
Geschlechtsdifferenzierung und den Einsatz der molekulargenetischen Untersuchung des
SRY Gens für die zukünftige klinische Diagnostik 68
6. ZUSAMMENFASSUNG 71
LITERATURVERZEICHNIS 73
3
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 4
1.1. Grundlagen der Geschlechtsdifferenzierung 4
1.1.1. Embryologie der Geschlechtsdifferenzierung 4
1.1.2. Genetische Faktoren der Geschlechtsdifferenzierung 5
1.2. Krankheitsbilder, welche zu Störungen der sexuellen Differenzierung führen können 7
1.2.1. Das Krankheitsbild der reinen gonadalen Dysgenesie 7
1.2.2. Andere Ursachen sexueller Differenzierungsstörungen 10
1.3. Diagnostische Vorgehensweise bei Störungen der Geschlechtsdifferenzierung 13
1.4. Zielstellung : 16
2. MATERIAL 17
2.1. Patienten 17
2.2. DNA 17
2.3. Geräte 17
2.4. Chemikalien 19
2.4.1. Reagenzien, Pufferund Stammlösungen 19
2.4.2. Standards und Farbstoffe 20
2.4.3. Enzyme 21
2.4.4. Kits 21
2.5. Primer 21
3. METHODEN 22
3.1. DNA Isolierung aus Vollblut 22
3.2. Qualitative und quantitative Bestimmung der DNA 23
3.3. Verfielfältigung der DNA Fragmente durch Polymerasekettenreaktion 23
3.3.1. Bestimmung der PCR Parameter 24
3.3.2. Reaktionsansatz und PCR Programm 25
3.4. Visualisierung der PCR Produkte durch Agarose Gelelektrophorese 26
3.5. Aufreinigung der PCR Produkte 27
3.6. Analyse der DNA Fragmente durch direkte DNA Sequenzierung 27
3.6.1. Bestimmung des Reaktionsansatzes und Sequenzierprogramms 28
3.6.2. Fällung der sequenzierten DNA Proben 29
1
3.6.3. Elektrophoretische Auftrennung und Detektion der Sequenzierprodukte im ABI
PRISM™ 377 DNA Sequenzierautomaten 30
3.6.4. Auswertung der Sequenzierungsergebnisse 31
3.7. Analyse der DNA mittels der denaturierenden Hochdruck Flüssigkeits Chromatographie
(DHPLC) 32
3.7.1. Durchfuhrung der DHPLC mittels des WAVE® Nucleic Fragment Analysis Systems 32
3.7.2. Chromatographische Auftrennung von Wildtyp und mutierter DNA mittels der
temperaturmodulierenden Heteroduplexanalyse 33
3.7.3. Durchfuhrung der DNA Analyse mit dem WAVE® System 34
3.7.4. Mutationsdetektion durch chromatographische Darstellung von Homo und
Heteroduplices 36
3.8. Retrospektive Erhebung der Patientendaten mittels eines hierfür erstellten Fragebogens 37
4. ERGEBNISSE 40
4.1. Etablierung der Polymerasekettenreaktion für die drei Fragmente des SRY Gens 40
4.2. Reinigung der PCR Produkte 42
4.3. Etablierung der Direktsequenzierung für den vollständigen DNA Abschnitt des SRY
Gens 43
4.4. Ergebnisse der Direktsequenzierung der SRY Region 43
4.5. Etabilierlung der DHPLC Analyse als Vorscreeningverfahren zur Mutationsdetektion der
DNA 44
4.5.1. Erstellung eines DHPLC Protokolls für jedes der drei Fragmente des SRY Gens 44
4.5.2. Bestimmung des optimalen Schmelzpunktes für die zu untersuchende DNA 44
4.5.3. Ermittlung des Fließmittelgradienten 46
4.6. Ergebnisse der Mutationsanalyse der mittels DHPLC Analyse untersuchten DNA 46
4.7. Auswertung der retrospektiv erhobenen Patientendaten 47
5. DISKUSSION 57
5.1.Methodenetablierung 57
5.2. Patienten mit dem Krankheitsbild der reinen gonadalen Dysgenesie 59
5.2.1. Die Bedeutung der SRY Region bei der Entstehung der reinen gonadalen Dysgenesie59
5.2.2. Die Bedeutung anderer Gene bei der Entstehung der reinen gonadalen Dysgenesie . 61
5.3. Patienten mit anderen Krankheitsbildern als Ursache der sexuellen
Differenzierungsstörung 66
2
5.4. Richtlinien für die diagnostische Vorgehensweise bei Störungen der
Geschlechtsdifferenzierung und den Einsatz der molekulargenetischen Untersuchung des
SRY Gens für die zukünftige klinische Diagnostik 68
6. ZUSAMMENFASSUNG 71
LITERATURVERZEICHNIS 73
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