Expression der Cysteinyl-Leukotrien-Rezeptoren 1 und 2 auf Zellen des peripheren Blutes: Evaluation einer Methode zur zentrenübergreifenden Forschung
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2006
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 4
1.1. Nutzen und Nebenwirkungen der Acetylsalicylsäure 4
1.2. Bedeutung und Vorkommen derCysteinyl Leukotrien Rezeptoren 11
1.3. Modulation der Expression der CysLTRI und 2 durch
Entzündungsmediatoren 16
1.4. Ziele der Doktorarbeit 18
2. Material und Methoden 20
2.1.1. Biologisches Material 20
2.1.2. Geräte 20
2.1.3. Chemikalien und weitere Reagenzien 21
2.1.4. Zellkultur 21
2.1.4.1. Zellkulturmedien 21
2.1.5. Pufferund Stammlösungen 22
2.1.6. Weitere Materialien 23
2.1.8. Kits 23
2.1.9. Oligonukleotidprimer 23
2.2.1. Zelluläre Methoden 24
2.2.1.1. Isolation von PBMC 24
2.2.1.2. Isolation von Monozyten 25
2.2.1.3. Kultur von humanen Dendritischen Zellen 25
2.2.1.4. Kulturbedingungen 26
2.2.2. Isolierung der Gesamt RNA aus Vollblut 26
2.2.3. Reverse Transkription der RNA ( RT PCR) 27
2.2.4. Polymerase Ketten Reaktion (PCR) 27
2.2.4.1. Herstellung von cDNA Standards mittels PCR für CysLTRI 27
2.2.4.2. Herstellung von cDNA Standards mittels PCR für CysLTR2 28
2.2.5. Reinigung der PCR Produkte 29
2.2.6. Agarosegel Elektrophorese 29
2.2.7. Quantifizierung der RNA mittels Echtzeit PCR 30
2.2.7.1. Real Time PCR für die RNA von CysLTRI 31
2.2.7.2. Real Time PCR für die RNA von CysLTR2 32
2.2.8. Untersuchungen zur Extraktionseffizienz von der RNA für CysLTRI
undCysLTR2 33
1
2.2.8.1. Lagerung der Vollblutprobe im RNA Stabilisierungspuffer bei
Raumtemperatur 33
2.2.8.2. Lagerung der Vollblutprobe im RNA Stabilisierungspuffer unter
Tiefkühlbedingungen 34
2.2.8.3. Ermittlung des optimalen Elutionsvolumens bei der RNA Isolation
34
2.2.9 RNA Expression von CysLTRI und CysLTR2 in verschiedenen Zellen
34
2.2.9.1. RNA Expression von CysLTRI und CysLTR2 auf Monozyten 34
2.2.9.2. RNA Expression von CysLTRI und CysLTR2 auf dendritischen Zellen
generiert aus Monozyten 35
3. Ergebnisse 36
3.1. Entwicklung einer Methode zur Quantifizierung der mRNA für CysLTRI
und CysLTR2 für Routineuntersuchungen 36
3.1.2. Charakteristika der Echtzeit PCR für die cDNA CysLTRI und
CysLTR2 40
3.1.3. Erstellung des Quantifizierungsstandards der cDNA CysLTRI und
CysLTR2 44
3.2. Einfluss der Lagerung auf die Extraktionseffizienz der RNA CysLTRI und
CysLTR2 45
3.2.1. Lagerung der Probengefäße bei Raumtemperatur vor Extraktion der
RNA 46
3.2.2. Einfluss der Lagertemperatur ( 20°C) auf die Widerfindung der RNA für
CysLTRI undCysLTR2 50
3.3.1. Beurteilung der Expression von CysLTRI und CysLTR2 auf
Monozyten 52
3.3.2. Beurteilung der Expression von CysLTRI und CysLTR2 in aus
Monozyten generierten dendritischen Zellen (MDDC) 54
4. Diskussion 57
4.1. Die Bedeutung eines geeigneten Transportmediums zur
zentrenübergreifenden Forschung zur Aspirin Intoleranz 57
4.2. Die zellspezifische Expression der Leukotrien Rezeptoren in Monozyten
und aus Monozyten generierten dendritischen Zellen (MDDC) 62
2
5. Zusammenfassung 65
6. Literaturverzeichnis 67
7. Anhang 67
7.1. Abkürzungsverzeichnis 72
7.2. Danksagung 74
7. 3. Lebenslauf 75
3
|
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 4
1.1. Nutzen und Nebenwirkungen der Acetylsalicylsäure 4
1.2. Bedeutung und Vorkommen derCysteinyl Leukotrien Rezeptoren 11
1.3. Modulation der Expression der CysLTRI und 2 durch
Entzündungsmediatoren 16
1.4. Ziele der Doktorarbeit 18
2. Material und Methoden 20
2.1.1. Biologisches Material 20
2.1.2. Geräte 20
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2.2.1. Zelluläre Methoden 24
2.2.1.1. Isolation von PBMC 24
2.2.1.2. Isolation von Monozyten 25
2.2.1.3. Kultur von humanen Dendritischen Zellen 25
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2.2.2. Isolierung der Gesamt RNA aus Vollblut 26
2.2.3. Reverse Transkription der RNA ( RT PCR) 27
2.2.4. Polymerase Ketten Reaktion (PCR) 27
2.2.4.1. Herstellung von cDNA Standards mittels PCR für CysLTRI 27
2.2.4.2. Herstellung von cDNA Standards mittels PCR für CysLTR2 28
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2.2.6. Agarosegel Elektrophorese 29
2.2.7. Quantifizierung der RNA mittels Echtzeit PCR 30
2.2.7.1. Real Time PCR für die RNA von CysLTRI 31
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2.2.8. Untersuchungen zur Extraktionseffizienz von der RNA für CysLTRI
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2.2.8.1. Lagerung der Vollblutprobe im RNA Stabilisierungspuffer bei
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2.2.8.2. Lagerung der Vollblutprobe im RNA Stabilisierungspuffer unter
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2.2.8.3. Ermittlung des optimalen Elutionsvolumens bei der RNA Isolation
34
2.2.9 RNA Expression von CysLTRI und CysLTR2 in verschiedenen Zellen
34
2.2.9.1. RNA Expression von CysLTRI und CysLTR2 auf Monozyten 34
2.2.9.2. RNA Expression von CysLTRI und CysLTR2 auf dendritischen Zellen
generiert aus Monozyten 35
3. Ergebnisse 36
3.1. Entwicklung einer Methode zur Quantifizierung der mRNA für CysLTRI
und CysLTR2 für Routineuntersuchungen 36
3.1.2. Charakteristika der Echtzeit PCR für die cDNA CysLTRI und
CysLTR2 40
3.1.3. Erstellung des Quantifizierungsstandards der cDNA CysLTRI und
CysLTR2 44
3.2. Einfluss der Lagerung auf die Extraktionseffizienz der RNA CysLTRI und
CysLTR2 45
3.2.1. Lagerung der Probengefäße bei Raumtemperatur vor Extraktion der
RNA 46
3.2.2. Einfluss der Lagertemperatur ( 20°C) auf die Widerfindung der RNA für
CysLTRI undCysLTR2 50
3.3.1. Beurteilung der Expression von CysLTRI und CysLTR2 auf
Monozyten 52
3.3.2. Beurteilung der Expression von CysLTRI und CysLTR2 in aus
Monozyten generierten dendritischen Zellen (MDDC) 54
4. Diskussion 57
4.1. Die Bedeutung eines geeigneten Transportmediums zur
zentrenübergreifenden Forschung zur Aspirin Intoleranz 57
4.2. Die zellspezifische Expression der Leukotrien Rezeptoren in Monozyten
und aus Monozyten generierten dendritischen Zellen (MDDC) 62
2
5. Zusammenfassung 65
6. Literaturverzeichnis 67
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7. 3. Lebenslauf 75
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