Funktionelle Expression von Toll-like Rezeptoren auf Mesangialzellen:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 8
1.1 Epidemiologie und Ursachen der Niereninsuffizienz 8
1.2 Aufbau und Funktion der Niere 9
1.3 Glomeruläre und tubuläre Schädigung 13
1.4 Chemokine und ihre Rezeptoren 14
1.4.1 Chemokine 14
1.4.2 Chemokinrezeptoren 16
1.4.3 Funktion des Chemokin/Chemokinrezeptorsystems 17
1.4.4 Renale Expression von Chemokinen und Chemokinrezeptoren 18
1.5 Toll like Rezeptoren 20
1.5.1 Signaltransduktion 21
1.5.2 TLR Liganden 23
1.5.3 Bedeutung von TLR4 und dessen Liganden 24
1.5.4 Expression von Chemokinen nach TLR Aktivierung 26
1.6 Zielsetzung 27
2 Material und Methoden 28
2.1 Materialien und Geräte 28
2.1.1 Geräte 28
2.1.2 Verbrauchsmaterialien und Plastikartikel 29
2.1.3 Chemikalien und Reagenzien 29
2.1.4 Zellkulturmedien und Zusätze 31
2.1.5 Stimulanzen 31
2.1.6 Antikörper 32
2.1.7 Enzyme und Inhibitoren 33
2.1.8 Kits 33
2.1.9 Molekulargewichtsstandards 33
2.1.10 Primersequenzen 34
2.1.11 Plasmide und Bakterien 35
2.1.12 Eukaryotische Zelllinien 36
2.2 Zellbiologische Methoden 36
2.2.1 Kulturbedingungen 36
2.2.2 Bestimmung von Zellzahl und Vitalität 36
2.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen 37
5
Inhaltsverzeichnis
2.2.4 Stimulationsexperimente 37
2.2.5 Transfektionen mit Short interfering RNA(siRNA) 38
2.2.6 Transfektionen mit Plasmiden 38
2.3 Molekularbiologische Methoden 39
2.3.1 Präparation und Analyse von RNA 39
2.3.2 Reverse Transkription 40
2.3.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 40
2.3.4 Quantitative real time PCR 41
2.3.5 Gelelektrophorese 42
2.3.6 DNA Klonierungen 43
2.3.7 RNase Protection Assay 46
2.3.8 Microarray Analyse 48
2.3.9 Inhibierung der Genexpression mittels RNA Interferenz 49
2.4 Immunologische Methoden 50
2.4.1 Enzyme Iinked immunosorbent assay (ELISA) 50
2.4.2 Durchflusszytometrie 51
2.4.3 CCL2 Bindungsassay 51
2.4.4 Herstellung von CCR11 Peptidantikörpern 52
2.5 Proteinchemische Methoden 53
2.5.1 Präparation von Proteinen 53
2.5.2 Proteingehaltsbestimmung 54
2.5.3 SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese(SDS PAGE) 54
2.5.4 Western Blotting 55
2.5.5 Proteindetektion 55
2.5.6 Dot Blot Analyse der CCR11 Peptidantikörper 56
2.6 Statistik 57
3 Ergebnisse 58
3.1 TLR Genexpression muriner Mesangialzellen 58
3.1.1 PCR Analyse der basalen TLR Genexpression 58
3.1.2 Real time RT PCR Analyse der basalen TLR Genexpression 59
3.1.3 Microarray Analyse der TLR Genexpression 60
3.1.4 Einfluss proinflammatorischer Zytokine auf die TLR Expression 61
3.2 TLR4 wird auf MMC funktionell exprimiert 63
3.2.1 Nachweis von TLR4 Protein in MMC 63
6
Inhaltsverzeichnis
3.2.2 TLR4 spezifische exogene Liganden aktivieren MMC 64
3.2.3 siRNA vermittelte Hemmung der Genexpression von TLR4 74
3.2.4 Stimulation mit endogenen Liganden 81
3.3 Die Rolle von Chemokinrezeptoren auf Mesangialzellen 92
3.3.1 Abwesenheit von CCR2 92
3.3.2 Bindung von CCL2 auf HMC 94
3.3.3 Expression von CCR11 auf HMC 95
3.3.4 CCR11 Expression in verschiedenen Geweben 98
3.3.5 CCR11 Proteinnachweis 99
4 Diskussion 101
4.1 TLR Expression auf murinen Mesangialzellen 102
4.2 Expression von Chemokinen nach TLR Aktivierung 106
4.3 Die Rolle von Chemokinrezeptoren auf Mesangialzellen 121
4.4 Ausblick 124
5 Zusammenfassung 126
6 Abkürzungen 128
7 Literaturverzeichnis 131
8 Anhang 151
8.1 Danksagung 151
8.2 Publikationen 153
8.3 Eidesstattliche Erklärung 155
7
|
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 8
1.1 Epidemiologie und Ursachen der Niereninsuffizienz 8
1.2 Aufbau und Funktion der Niere 9
1.3 Glomeruläre und tubuläre Schädigung 13
1.4 Chemokine und ihre Rezeptoren 14
1.4.1 Chemokine 14
1.4.2 Chemokinrezeptoren 16
1.4.3 Funktion des Chemokin/Chemokinrezeptorsystems 17
1.4.4 Renale Expression von Chemokinen und Chemokinrezeptoren 18
1.5 Toll like Rezeptoren 20
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1.5.4 Expression von Chemokinen nach TLR Aktivierung 26
1.6 Zielsetzung 27
2 Material und Methoden 28
2.1 Materialien und Geräte 28
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2.1.10 Primersequenzen 34
2.1.11 Plasmide und Bakterien 35
2.1.12 Eukaryotische Zelllinien 36
2.2 Zellbiologische Methoden 36
2.2.1 Kulturbedingungen 36
2.2.2 Bestimmung von Zellzahl und Vitalität 36
2.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen 37
5
Inhaltsverzeichnis
2.2.4 Stimulationsexperimente 37
2.2.5 Transfektionen mit Short interfering RNA(siRNA) 38
2.2.6 Transfektionen mit Plasmiden 38
2.3 Molekularbiologische Methoden 39
2.3.1 Präparation und Analyse von RNA 39
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2.3.9 Inhibierung der Genexpression mittels RNA Interferenz 49
2.4 Immunologische Methoden 50
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2.4.2 Durchflusszytometrie 51
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2.4.4 Herstellung von CCR11 Peptidantikörpern 52
2.5 Proteinchemische Methoden 53
2.5.1 Präparation von Proteinen 53
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2.5.3 SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese(SDS PAGE) 54
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2.5.5 Proteindetektion 55
2.5.6 Dot Blot Analyse der CCR11 Peptidantikörper 56
2.6 Statistik 57
3 Ergebnisse 58
3.1 TLR Genexpression muriner Mesangialzellen 58
3.1.1 PCR Analyse der basalen TLR Genexpression 58
3.1.2 Real time RT PCR Analyse der basalen TLR Genexpression 59
3.1.3 Microarray Analyse der TLR Genexpression 60
3.1.4 Einfluss proinflammatorischer Zytokine auf die TLR Expression 61
3.2 TLR4 wird auf MMC funktionell exprimiert 63
3.2.1 Nachweis von TLR4 Protein in MMC 63
6
Inhaltsverzeichnis
3.2.2 TLR4 spezifische exogene Liganden aktivieren MMC 64
3.2.3 siRNA vermittelte Hemmung der Genexpression von TLR4 74
3.2.4 Stimulation mit endogenen Liganden 81
3.3 Die Rolle von Chemokinrezeptoren auf Mesangialzellen 92
3.3.1 Abwesenheit von CCR2 92
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3.3.3 Expression von CCR11 auf HMC 95
3.3.4 CCR11 Expression in verschiedenen Geweben 98
3.3.5 CCR11 Proteinnachweis 99
4 Diskussion 101
4.1 TLR Expression auf murinen Mesangialzellen 102
4.2 Expression von Chemokinen nach TLR Aktivierung 106
4.3 Die Rolle von Chemokinrezeptoren auf Mesangialzellen 121
4.4 Ausblick 124
5 Zusammenfassung 126
6 Abkürzungen 128
7 Literaturverzeichnis 131
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8.1 Danksagung 151
8.2 Publikationen 153
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