Lymphotoxin-beta-Rezeptor: Bedeutung für Tumorwachstum und Mastzell-Aktivierung
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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| Veröffentlicht: |
2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis L
I Inhaltsverzeichnis
I Inhaltsverzeichnis 1
II Abkürzungsverzeichnis 4
1 Einleitung 7
1.1 Das Immunsystem 7
1.2 Das Lymhotoxin ß Rezeptor / Ligand System 7
1.3 Funktionen vom LTßR 10
1.4 Aktivierung von NFkB durch den LTßR 13
1.5 LTßR Aktivierung und Tumorentstehung 14
1.6 Tumorwachstum 16
1.7 Mastzellen 17
1.8 Funktionen von Mastzellen 18
1.9 Subtypenvon Mastzellen 20
1.10 Transgene Mäuse 21
1.11 Das Cre / LoxP System 23
2 Ziele 25
3 Material 26
3.1 Chemikalien und Reagenzien 26
3.2 Verbrauchsmaterial und Geräte 27
3.3 Kits 29
3.4 Molekulargewichtsstandards 29
3.5 Antikörper und Enzyme 29
3.6 Vektoren 30
3.7 Oligonukleotide 30
3.8 Puffer und Lösungen 32
3.9 Zellinien 34
3.10 Zytokine 35
3.11 Mauslinien 35
4 Methoden 36
4.1 Tierexperimentelle Methoden 36
4.1.1 Mäuse 36
4.1.2 Erzeugung von Fibrosarkomen (BFS 1 Zellen) 36
4.1.3 Messung des BFS 1 Tumorwachstums 37
4.1.4 Entnahme von BFS 1 Fibrosarkomen 37
4.1.5 Organentnahme von Chymase Cre / ROSA26R Mäusen 37
4.1.6 Gewinnung von Peritonealzellen 38
4.1.7 Gewinnung von Knochenmark zur Herstellung von BMMC 38
4.2 Histologische Methoden 39
4.2.1 Diff Quik Färbung 39
4.2.2 X Gal Färbung 39
4.2.2.1 X Gal Färbung ganzer Organteile 39
4.2.2.2 X Gal Färbung von Cryoschnitten 40
4.2.3 Immunhistochemische Färbungen von CD3 und B220 40
4.2.4 Immunhistochemische Färbungen von CD4 und CD8 41
4.2.5 Immunhistochemische Färbung von CD31 41
4.2.6 Fluoreszenz Immunhistochemische Färbung von CD31 und CD34 42
4.3 Zellbiologische Methoden 43
4.3.1 Zellkulturbedingungen 43
4.3.2 Auftauen und Einfrieren von Zellen 43
4.3.3 Bestimmung der Lebendzellzahl 43
Inhaltsverzeichnis 2
4.3.4 Mycoplasmentest 44
4.3.5 Induktion von PMM1 Zellen mit lonomycin und PMA 44
4.3.6 Kultur von CFS 1 LacZ Zellen 44
4.3.7 Herstellung von BMMC 44
4.3.8 Zytozentrifugationspräparate 45
4.3.9 Transfektion von YFP Reporterkonstrukten in L929 Zellen mittels
DOTAB 45
4.3.10 Transfektion von YFP Reporterkonstrukten in L138.8A Zellen mittels
Elektroporation 45
4.3.11 FACS Messung von c kit / LacZ positiven Zellen 46
4.4 Molekularbiologische Methoden 47
4.4.1 Bakterienkultur 47
4.4.2 Herstellung von Dauerkulturen 47
4.4.3 Transformation von E.coli 48
4.4.4 Blau Weiss Selektion 48
4.4.5 Arbeiten mit DNA 49
4.4.5.1 Isolierung von Plasmid DNA aus E. coli 49
4.4.5.2 Isolierung von genomischer DNA aus Mausschwänzen 49
4.4.5.3 Analytische und präperative Gelelektrophorese 50
4.4.5.4 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 51
4.4.5.4.1 PCR zu Klonierungen 51
4.4.5.4.2 PCR zur Genotypisierung konditioneller LT/? Mäuse 52
4.4.5.4.3 PCR zur Genotypisierung von Chymase Cre / ROSA26R Mäusen 53
4.4.5.5 Restriktionsverdau von DNA 54
4.4.5.6 Ligation von DNA Fragmenten 54
4.4.5.7 Sequenzierung von Plasmid DNA 54
4.4.5.8 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 54
4.4.5.9 Southem Blot von genomischer DNA 55
4.4.6 Arbeiten mit RNA 56
4.4.6.1 Isolierung von Gesamt RNA aus Gewebe 56
4.4.6.2 Isolierung von Gesamt RNA aus Zellen 57
4.4.6.3 Reverse Transkription (RT) 57
4.4.6.4 Quantitative PCR 59
4.5 Statistik 61
5 Ergebnisse 62
5.1 Das LTßR abhängige BFS 1 Tumormodell 62
5.1.1 Modell 62
5.1.1.1 BFS 1 Tumorwachstum auf LTaß^ Mäusen 63
5.1.1.2 LTßR Transkription in BFS 1 Zellen und größeren Tumoren 63
5.2 Das BFS 1 Tumormodell in konditionellen LTß^ Mäusen 64
5.2.1 Zucht der konditionellen LTß^ Mäuse 65
5.2.2 BFS 1 Tumorwachstum auf konditionellen LTßv Mäusen 68
5.2.3 CD3 und B220 Färbung der BFS 1 Tumoren konditionelter
LTß^ MSuse 69
5.2.4 CD4 und CD8 Färbung der BFS 1 Tumoren konditioneller LTß^ Mäuse 70
5.2.5 CD31 (PECAM) Färbung der BFS 1 Tumoren konditioneller
LTß^ Mäuse 71
5.3 Das BFS 1 Tumormodell in LIGHT^ Mäusen 71
5.3.1 BFS 1 Tumorwachstum auf LIGHT Mäusen 72
5.3.2 CD3 und B220 Färbung der BFS 1 Tumoren von LIGHT^ Mäusen... 73
5.3.3 CD4 und CD8 Färbung der BFS 1 Tumoren von LIGHT^ Mäusen. 74
Inhaltsverzeichnis 3
5.3.4 CD31 (PECAM) undCD34 Färbungder BFS 1 Tumoren von
LIGHT Mäusen 75
5.4 Überprüfung der MIP 2 mRNA in größeren Tumoren von LTßR Ligand
gendefizienten Mäusen 76
5.5 Das BFS 1 Tumorwachstum in frühen Tumoren 76
5.5.1 CD3 und B220 Färbung der frühen BFS 1 Tumoren von LTßR Ligand
defizienten Mäusen 77
5.5.2 CD31 und CD34 Färbung der frühen BFS 1 Tumoren von LTßR Ligand
defizenten Mäusen 79
5.5.3 Überprüfung der MIP 2 mRNA Mengen in frühen Tumoren von LTßR
Ligand gendefizienten Mäusen 81
5.6 Überprüfung der HVEM mRNA Mengen in BFS 1 Zellen und Tumoren. 82
5.7 Herstellung einer Chymase Cre Deleter Maus 83
5.7.1 Das Chymase Cre Vektorkonstrukt 83
5.7.1.1 Klonierung des Chymase Promotors 84
5.7.1.1.1 Sequenz und Bindestellen 84
5.7.1.2 Klonierung des Cre Gens 85
5.7.1.3 Herstellung des Chymase Cre Vektorkonstrukts 86
5.7.2 Überprüfung des Chymase Promotors in vitro 88
5.7.2.1 Klonierung von YFP Reporterkonstrukten 88
5.7.2.2 Transfektionen der YFP Reporterkonstrukte in L929 und
L138.8A 2ellen 89
5.7.3 Herstellung der Chymase Cre transgenen Mauslinie 90
5.7.4 Nachweis des Chymase Cre Transgens im Genom 91
5.7.4.1 Southern Hybridisierung zum Nachweis des Transgens 92
5.7.4.2 Southern Hybridisierung zur Untersuchung der Integrationshäufigkeit des
Transgens 94
5.7.4.3 Etablierung einer PCR zur Detektion des Transgens 95
5.7.5 Test der transgenen Mauslinien 96
5.7.5.1 Modell der ROSA26 Reportermaus 96
5.7.5.2 Weitergabe des Transgens 97
5.7.5.3 Nachweis der Transkription des Transgens 99
5.7.5.4 X Gal Färbung von Organteilen aus Chymase Cre / ROSA26R
Nachkommen der Foundertiere 101
5.7.5.5 Überprüfung der LacZ Produktion peritonealer Mastzellen aus Chymase
Cre / ROSA26R Nachkommen 104
5.7.5.6 Überprüfung der LacZ Produktion in Knochenmark generierten Mastzellen
der Chymase Cre / ROSA26R Nachkommen 106
5.7.5.7 Überprüfung der Cre mRNA Mengen aus Knochenmark generierten
Mastzellen von Chymase Cre ROSA26R Nachkommen 109
6 Diskussion 110
6.1 LTßR abhängiges BFS 1 Tumorwachstum 110
6.2 Herstellung und Charakterisierung einer Mastzeil spezifischen
Cre Deleter Maus 119
7 Zusammenfassung 125
8 Literatur Liste . 127
9 Danksagung .„.™.i™._™....i 145
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis L
I Inhaltsverzeichnis
I Inhaltsverzeichnis 1
II Abkürzungsverzeichnis 4
1 Einleitung 7
1.1 Das Immunsystem 7
1.2 Das Lymhotoxin ß Rezeptor / Ligand System 7
1.3 Funktionen vom LTßR 10
1.4 Aktivierung von NFkB durch den LTßR 13
1.5 LTßR Aktivierung und Tumorentstehung 14
1.6 Tumorwachstum 16
1.7 Mastzellen 17
1.8 Funktionen von Mastzellen 18
1.9 Subtypenvon Mastzellen 20
1.10 Transgene Mäuse 21
1.11 Das Cre / LoxP System 23
2 Ziele 25
3 Material 26
3.1 Chemikalien und Reagenzien 26
3.2 Verbrauchsmaterial und Geräte 27
3.3 Kits 29
3.4 Molekulargewichtsstandards 29
3.5 Antikörper und Enzyme 29
3.6 Vektoren 30
3.7 Oligonukleotide 30
3.8 Puffer und Lösungen 32
3.9 Zellinien 34
3.10 Zytokine 35
3.11 Mauslinien 35
4 Methoden 36
4.1 Tierexperimentelle Methoden 36
4.1.1 Mäuse 36
4.1.2 Erzeugung von Fibrosarkomen (BFS 1 Zellen) 36
4.1.3 Messung des BFS 1 Tumorwachstums 37
4.1.4 Entnahme von BFS 1 Fibrosarkomen 37
4.1.5 Organentnahme von Chymase Cre / ROSA26R Mäusen 37
4.1.6 Gewinnung von Peritonealzellen 38
4.1.7 Gewinnung von Knochenmark zur Herstellung von BMMC 38
4.2 Histologische Methoden 39
4.2.1 Diff Quik Färbung 39
4.2.2 X Gal Färbung 39
4.2.2.1 X Gal Färbung ganzer Organteile 39
4.2.2.2 X Gal Färbung von Cryoschnitten 40
4.2.3 Immunhistochemische Färbungen von CD3 und B220 40
4.2.4 Immunhistochemische Färbungen von CD4 und CD8 41
4.2.5 Immunhistochemische Färbung von CD31 41
4.2.6 Fluoreszenz Immunhistochemische Färbung von CD31 und CD34 42
4.3 Zellbiologische Methoden 43
4.3.1 Zellkulturbedingungen 43
4.3.2 Auftauen und Einfrieren von Zellen 43
4.3.3 Bestimmung der Lebendzellzahl 43
Inhaltsverzeichnis 2
4.3.4 Mycoplasmentest 44
4.3.5 Induktion von PMM1 Zellen mit lonomycin und PMA 44
4.3.6 Kultur von CFS 1 LacZ Zellen 44
4.3.7 Herstellung von BMMC 44
4.3.8 Zytozentrifugationspräparate 45
4.3.9 Transfektion von YFP Reporterkonstrukten in L929 Zellen mittels
DOTAB 45
4.3.10 Transfektion von YFP Reporterkonstrukten in L138.8A Zellen mittels
Elektroporation 45
4.3.11 FACS Messung von c kit / LacZ positiven Zellen 46
4.4 Molekularbiologische Methoden 47
4.4.1 Bakterienkultur 47
4.4.2 Herstellung von Dauerkulturen 47
4.4.3 Transformation von E.coli 48
4.4.4 Blau Weiss Selektion 48
4.4.5 Arbeiten mit DNA 49
4.4.5.1 Isolierung von Plasmid DNA aus E. coli 49
4.4.5.2 Isolierung von genomischer DNA aus Mausschwänzen 49
4.4.5.3 Analytische und präperative Gelelektrophorese 50
4.4.5.4 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 51
4.4.5.4.1 PCR zu Klonierungen 51
4.4.5.4.2 PCR zur Genotypisierung konditioneller LT/?'' Mäuse 52
4.4.5.4.3 PCR zur Genotypisierung von Chymase Cre / ROSA26R Mäusen 53
4.4.5.5 Restriktionsverdau von DNA 54
4.4.5.6 Ligation von DNA Fragmenten 54
4.4.5.7 Sequenzierung von Plasmid DNA 54
4.4.5.8 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 54
4.4.5.9 Southem Blot von genomischer DNA 55
4.4.6 Arbeiten mit RNA 56
4.4.6.1 Isolierung von Gesamt RNA aus Gewebe 56
4.4.6.2 Isolierung von Gesamt RNA aus Zellen 57
4.4.6.3 Reverse Transkription (RT) 57
4.4.6.4 Quantitative PCR 59
4.5 Statistik 61
5 Ergebnisse 62
5.1 Das LTßR abhängige BFS 1 Tumormodell 62
5.1.1 Modell 62
5.1.1.1 BFS 1 Tumorwachstum auf LTaß^' Mäusen 63
5.1.1.2 LTßR Transkription in BFS 1 Zellen und größeren Tumoren 63
5.2 Das BFS 1 Tumormodell in konditionellen LTß^' Mäusen 64
5.2.1 Zucht der konditionellen LTß^ Mäuse 65
5.2.2 BFS 1 Tumorwachstum auf konditionellen LTßv" Mäusen 68
5.2.3 CD3 und B220 Färbung der BFS 1 Tumoren konditionelter
LTß^ MSuse 69
5.2.4 CD4 und CD8 Färbung der BFS 1 Tumoren konditioneller LTß^' Mäuse 70
5.2.5 CD31 (PECAM) Färbung der BFS 1 Tumoren konditioneller
LTß^ Mäuse 71
5.3 Das BFS 1 Tumormodell in LIGHT^ Mäusen 71
5.3.1 BFS 1 Tumorwachstum auf LIGHT"'" Mäusen 72
5.3.2 CD3 und B220 Färbung der BFS 1 Tumoren von LIGHT^ Mäusen. 73
5.3.3 CD4 und CD8 Färbung der BFS 1 Tumoren von LIGHT^ Mäusen. 74
Inhaltsverzeichnis 3
5.3.4 CD31 (PECAM) undCD34 Färbungder BFS 1 Tumoren von
LIGHT'" Mäusen 75
5.4 Überprüfung der MIP 2 mRNA in größeren Tumoren von LTßR Ligand
gendefizienten Mäusen 76
5.5 Das BFS 1 Tumorwachstum in frühen Tumoren 76
5.5.1 CD3 und B220 Färbung der frühen BFS 1 Tumoren von LTßR Ligand
defizienten Mäusen 77
5.5.2 CD31 und CD34 Färbung der frühen BFS 1 Tumoren von LTßR Ligand
defizenten Mäusen 79
5.5.3 Überprüfung der MIP 2 mRNA Mengen in frühen Tumoren von LTßR
Ligand gendefizienten Mäusen 81
5.6 Überprüfung der HVEM mRNA Mengen in BFS 1 Zellen und Tumoren. 82
5.7 Herstellung einer Chymase Cre Deleter Maus 83
5.7.1 Das Chymase Cre Vektorkonstrukt 83
5.7.1.1 Klonierung des Chymase Promotors 84
5.7.1.1.1 Sequenz und Bindestellen 84
5.7.1.2 Klonierung des Cre Gens 85
5.7.1.3 Herstellung des Chymase Cre Vektorkonstrukts 86
5.7.2 Überprüfung des Chymase Promotors in vitro 88
5.7.2.1 Klonierung von YFP Reporterkonstrukten 88
5.7.2.2 Transfektionen der YFP Reporterkonstrukte in L929 und
L138.8A 2ellen 89
5.7.3 Herstellung der Chymase Cre transgenen Mauslinie 90
5.7.4 Nachweis des Chymase Cre Transgens im Genom 91
5.7.4.1 Southern Hybridisierung zum Nachweis des Transgens 92
5.7.4.2 Southern Hybridisierung zur Untersuchung der Integrationshäufigkeit des
Transgens 94
5.7.4.3 Etablierung einer PCR zur Detektion des Transgens 95
5.7.5 Test der transgenen Mauslinien 96
5.7.5.1 Modell der ROSA26 Reportermaus 96
5.7.5.2 Weitergabe des Transgens 97
5.7.5.3 Nachweis der Transkription des Transgens 99
5.7.5.4 X Gal Färbung von Organteilen aus Chymase Cre / ROSA26R
Nachkommen der Foundertiere 101
5.7.5.5 Überprüfung der LacZ Produktion peritonealer Mastzellen aus Chymase
Cre / ROSA26R Nachkommen 104
5.7.5.6 Überprüfung der LacZ Produktion in Knochenmark generierten Mastzellen
der Chymase Cre / ROSA26R Nachkommen 106
5.7.5.7 Überprüfung der Cre mRNA Mengen aus Knochenmark generierten
Mastzellen von Chymase Cre ROSA26R Nachkommen 109
6 Diskussion 110
6.1 LTßR abhängiges BFS 1 Tumorwachstum 110
6.2 Herstellung und Charakterisierung einer Mastzeil spezifischen
Cre Deleter Maus 119
7 Zusammenfassung 125
8 Literatur Liste '. 127
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