Auswirkungen der IDO-Inhibition auf die In-vitro-Zytokin-Produktion peripherer mononukleärer Blutzellen einer repräsentativen Stichprobe gesunder Probanden unter Berücksichtigung der Zytokin-Gen-Polymorphismen:
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2007
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis Seite
1. Einleitung 6
1.1 Tryptophan Metabolismus 6
1.1.1 Konversion von Tryptophan zu Serotonin 6
1.1.2 Abbau von Tryptophan über den Kynurenin Weg 6
1.1.2.1 Expression und Induktion der Indolamin 2,3 Dioxygenase (IDO) 7
1.1.2.2 Metaboliten des Kynurenin Wegs 9
1.1.2.3 IDO und Depression 9
1.1.2.4 IDO als Immunmodulator 10
1.1.2.5 Norharman 13
1.2 Zytokine in der vorliegenden Arbeit 14
1.2.1 Interferon gamma (IFN v) 15
1.2.1.1 Produktion und Funktionen von IFN y 15
1.2.1.2 IFN y Gen 15
1.2.2 Interleukin 6 (IL 6) 16
1.2.2.1 Produktion und Funktionen von IL 6 16
1.2.2.2 IL 6 Gen 18
1.3 Fragestellung der vorliegenden Arbeit 19
2. Material und Methoden 20
2.1 Versuchsmaterial 20
2.1.1 Probanden 20
2.1.2 BuffyCoats 21
2.2 Zellverarbeitung und Zellkultur 21
2.2.1 Medienherstellung 21
2.2.2 Isolierung von Zellen: Ficoll Trennung zum Erhalt monozytärer 22
weißer Blutzellen aus Vollblut
2.2.3 Einfrieren von Zellen 22
2.2.4 Zellisolierung aus Buffy Coats 23
2.2.5 Auftauen von Zellen 23
2.2.6 Zählen von Zellen 24
2.2.7 Stimulation der Zellen 24
2.2.8 Verarbeitung der Zellkultur Überstände 25
2.2.9 Auswertung der Zellkultur Überstände 25
2.3 Inhibition der IDO mit Norharman 26
2.3.1 Steriles Abwiegen von Norharman 26
2.3.2 Lösen von Norharman 27
2.3.3 Vorbereitungen für die Norharman Verdünnungsreihe 27
2.3.4 Versuchsaufbau 27
2.3.5 Versuchs Durchführung 28
2.4 Genetik 29
2.4.1 DNA Isolierung 29
2.4.2 Genotypisierung 30
2.4.2.1 Analyse des IFN y Polymorphismus 30
2.4.2.2 Analyse des IL 6 Polymorphismus 30
2.5 Datenauswertung 31
3. Ergebnisse 33
3.1 Entwicklung des Zellkulturversuchs zur IDO Inhibition 33
3.1.1 Lösung von Norharman 33
3.1.2 Konzentrationsbereich der IDO Inhibition mit Norharman 34
3.2 Zellkultur Untersuchungen 36
3.2.1 Zytokin Produktion unter Zellstimulation mit PHA 36
3.2.1.1 Intraindividuelle Varianz in der Zytokin Produktion 37
3.2.1.2 Vergleich der Zytokin Produktion von Vor und Hauptstudie 38
3.2.1.3 Zusammenhang zwischen IFN y und IL 6 Produktion 39
3.2.1.4 Zusammenhang von Zytokin Produktion und Geschlecht 40
3.2.1.5 Zusammenhang von Zytokin Produktion und Einnahme von 40
Ovulationshemmern
3.2.2 Zytokin Produktion unter IDO Inhibition 41
3.2.2.1 IDO Inhibition: Vorstudie 42
3.2.2.1.1 Interferon gamma 42
3.2.2.1.2 Interleukin 6 44
3.2.2.2 IDO Inhibition: Hauptstudie 46
3.2.2.2.1 Interferon gamma 46
3.2.2.2.2 Interleukin 6 49
3.2.2.3 Intraindividuelle Varianz unter IDO Inhibition 51
3.2.2.4 Vergleich der Reaktion auf IDO Inhibition zwischen Vor und 54
Hauptstudie
3.2.2.5 Vergleich der beiden Zytokine unter IDO Inhibition 54
3.2.2.6 Einflussfaktoren auf die Zytokin Produktion unter IDO Inhibition 56
3.2.2.6.1 Höhe der Zytokin Produktion 56
3.2.2.6.2 Geschlecht 56
3.2.2.6.3 Ovulationshemmer 57
3.2.2.7 Zusätzliche Untersuchungen: DMSO Kontrollen 58
3.3 Genetik 60
3.3.1 Interferon y, CA Repeat Polymorphismus 60
3.3.1.1 Allel Frequenzen und Haplotypen Häufigkeiten in der eigenen Studie 60
3.3.1.2 Haplotypen und Allel Frequenzen des CA Repeats im Vergleich zu 61
publizierten Daten
3.3.2 Interleukin 6, Single Nucleotid Polymorphismus 174 G »C 62
3.3.2.1 Allel Frequenzen und Genotypen Häufigkeiten in der eigenen Studie 62
3.3.2.2 Genotypen und Allel Frequenzen des IL 6 SNP 174G C im 63
Vergleich zu publizierten Daten
3.4 Zusammenhang zwischen Zellkultur Ergebnissen und Genetik 64
3.4.1 Zusammenhang von Zytokin Produktion unter PHA Stimulation und 64
Genetik
3.4.1.1 Interferon gamma 64
3.4.1.2 Interleukin 6 67
3.4.2 Zusammenhang von Zytokin Produktion unter IDO Inhibition und 69
Genetik
3.4.2.1 Interferon gamma 69
3.4.2.2 Interleukin 6 73
4. Diskussion 75
4.1 Methodik der Zellstimulation und der IDO Inhibition mit Norharman 76
4.1.1 Zellkultur mit PBMC 76
4.1.2 IDO Inhibition mit Norharman 77
4.1.2.1 Norharman als IDO Inhibitor und Lösung von Norharman mit DMSO 77
4.1.2.2 Konzentrationsbereich der IDO Inhibition mit Norharman 79
4.2 Zellkulturversuche 80
4.2.1 Auswirkung der IDO Inhibition auf die Zytokin Produktion durch 80
PBMC Gesamtbetrachtung
4.2.2 Zytokin Produktion durch PBMC unter Stimulation mit PHA 83
4.2.3 Zytokin Produktion unter IDO Inhibition 85
4.2.3.1 Intraindividuelle Schwankungen unter IDO Inhibition 86
4.2.3.2 Effekt unterschiedlicher Stimulationskonditionen auf die IDO 87
Inhibition
4.2.3.3 Vergleich der Reaktionen der beiden Zytokine auf IDO Inhibition 88
4.2.3.4 Weitere Einflussfaktoren auf die Zytokin Produktion unter IDO 88
Inhibition
4.3 Genetik: Zytokin Gen Polymorphismen 89
4.3.1 CA Repeat Polymorphismus des Interferon y Gens 89
4.3.2 174 G—?C Single Nucleotid Polymorphismus des Interleukin 6 Gens 90
4.4 Zusammenhang zwischen Zellkultur Ergebnissen und Genetik 91
4.4.1 Zusammenhang zwischen Zytokin Produktion und Genetik 91
4.4.1.1 IFN y Produktion und CA Repeat Polymorphismus 91
4.4.1.2 IL 6 Produktion und 174 G »C Polymorphismus des EL 6 Gens 93
4.4.2 Zusammenhang zwischen Zytokin Produktion unter IDO Inhibition 94
und Genotyp des entsprechenden Zytokin Gens
4.4.2.1 Interferon gamma 94
4.4.2.2 Interleukin 6 96
4.5 Gesamtbetrachtung und Ausblick 98
5. Zusammenfassung 99
6. Literaturverzeichnis 102
7. Anhang 117
7.1 Abkürzungen 117
7.2 Geräte und Materialien 117
7.2.1 Zellkultur: Probenverarbeitung und Zellkulturversuche 117
7.2.1.1 Geräte 117
7.2.1.2 Arbeitsgegenstände 118
7.2.1.3 Verbrauchsmaterial 119
7.2.1.4 Reagenzien 120
7.2.1.5 Chemikalien 120 •
7.2.2 ELISA Untersuchungen 120
7.2.2.1 Geräte 120
7.2.2.2 Verbrauchsmaterial 121
7.2.2.3 Reagenzien 121
7.2.2.4 Chemikalien 121
7.2.2.5 Pufferlösungen 122
7.2.3 Genetik 122
7.2.3.1 Probenverarbeitung 122
7.2.3.2 Polymerase Ketten Reaktion 122
7.2.3.3 Sequenzierung 123
7.3 Tabellen 124
7.4 Lebenslauf 126
7.5 Danksagung 126
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis Seite
1. Einleitung 6
1.1 Tryptophan Metabolismus 6
1.1.1 Konversion von Tryptophan zu Serotonin 6
1.1.2 Abbau von Tryptophan über den Kynurenin Weg 6
1.1.2.1 Expression und Induktion der Indolamin 2,3 Dioxygenase (IDO) 7
1.1.2.2 Metaboliten des Kynurenin Wegs 9
1.1.2.3 IDO und Depression 9
1.1.2.4 IDO als Immunmodulator 10
1.1.2.5 Norharman 13
1.2 Zytokine in der vorliegenden Arbeit 14
1.2.1 Interferon gamma (IFN v) 15
1.2.1.1 Produktion und Funktionen von IFN y 15
1.2.1.2 IFN y Gen 15
1.2.2 Interleukin 6 (IL 6) 16
1.2.2.1 Produktion und Funktionen von IL 6 16
1.2.2.2 IL 6 Gen 18
1.3 Fragestellung der vorliegenden Arbeit 19
2. Material und Methoden 20
2.1 Versuchsmaterial 20
2.1.1 Probanden 20
2.1.2 BuffyCoats 21
2.2 Zellverarbeitung und Zellkultur 21
2.2.1 Medienherstellung 21
2.2.2 Isolierung von Zellen: Ficoll Trennung zum Erhalt monozytärer 22
weißer Blutzellen aus Vollblut
2.2.3 Einfrieren von Zellen 22
2.2.4 Zellisolierung aus Buffy Coats 23
2.2.5 Auftauen von Zellen 23
2.2.6 Zählen von Zellen 24
2.2.7 Stimulation der Zellen 24
2.2.8 Verarbeitung der Zellkultur Überstände 25
2.2.9 Auswertung der Zellkultur Überstände 25
2.3 Inhibition der IDO mit Norharman 26
2.3.1 Steriles Abwiegen von Norharman 26
2.3.2 Lösen von Norharman 27
2.3.3 Vorbereitungen für die Norharman Verdünnungsreihe 27
2.3.4 Versuchsaufbau 27
2.3.5 Versuchs Durchführung 28
2.4 Genetik 29
2.4.1 DNA Isolierung 29
2.4.2 Genotypisierung 30
2.4.2.1 Analyse des IFN y Polymorphismus 30
2.4.2.2 Analyse des IL 6 Polymorphismus 30
2.5 Datenauswertung 31
3. Ergebnisse 33
3.1 Entwicklung des Zellkulturversuchs zur IDO Inhibition 33
3.1.1 Lösung von Norharman 33
3.1.2 Konzentrationsbereich der IDO Inhibition mit Norharman 34
3.2 Zellkultur Untersuchungen 36
3.2.1 Zytokin Produktion unter Zellstimulation mit PHA 36
3.2.1.1 Intraindividuelle Varianz in der Zytokin Produktion 37
3.2.1.2 Vergleich der Zytokin Produktion von Vor und Hauptstudie 38
3.2.1.3 Zusammenhang zwischen IFN y und IL 6 Produktion 39
3.2.1.4 Zusammenhang von Zytokin Produktion und Geschlecht 40
3.2.1.5 Zusammenhang von Zytokin Produktion und Einnahme von 40
Ovulationshemmern
3.2.2 Zytokin Produktion unter IDO Inhibition 41
3.2.2.1 IDO Inhibition: Vorstudie 42
3.2.2.1.1 Interferon gamma 42
3.2.2.1.2 Interleukin 6 44
3.2.2.2 IDO Inhibition: Hauptstudie 46
3.2.2.2.1 Interferon gamma 46
3.2.2.2.2 Interleukin 6 49
3.2.2.3 Intraindividuelle Varianz unter IDO Inhibition 51
3.2.2.4 Vergleich der Reaktion auf IDO Inhibition zwischen Vor und 54
Hauptstudie
3.2.2.5 Vergleich der beiden Zytokine unter IDO Inhibition 54
3.2.2.6 Einflussfaktoren auf die Zytokin Produktion unter IDO Inhibition 56
3.2.2.6.1 Höhe der Zytokin Produktion 56
3.2.2.6.2 Geschlecht 56
3.2.2.6.3 Ovulationshemmer 57
3.2.2.7 Zusätzliche Untersuchungen: DMSO Kontrollen 58
3.3 Genetik 60
3.3.1 Interferon y, CA Repeat Polymorphismus 60
3.3.1.1 Allel Frequenzen und Haplotypen Häufigkeiten in der eigenen Studie 60
3.3.1.2 Haplotypen und Allel Frequenzen des CA Repeats im Vergleich zu 61
publizierten Daten
3.3.2 Interleukin 6, Single Nucleotid Polymorphismus 174 G »C 62
3.3.2.1 Allel Frequenzen und Genotypen Häufigkeiten in der eigenen Studie 62
3.3.2.2 Genotypen und Allel Frequenzen des IL 6 SNP 174G C im 63
Vergleich zu publizierten Daten
3.4 Zusammenhang zwischen Zellkultur Ergebnissen und Genetik 64
3.4.1 Zusammenhang von Zytokin Produktion unter PHA Stimulation und 64
Genetik
3.4.1.1 Interferon gamma 64
3.4.1.2 Interleukin 6 67
3.4.2 Zusammenhang von Zytokin Produktion unter IDO Inhibition und 69
Genetik
3.4.2.1 Interferon gamma 69
3.4.2.2 Interleukin 6 73
4. Diskussion 75
4.1 Methodik der Zellstimulation und der IDO Inhibition mit Norharman 76
4.1.1 Zellkultur mit PBMC 76
4.1.2 IDO Inhibition mit Norharman 77
4.1.2.1 Norharman als IDO Inhibitor und Lösung von Norharman mit DMSO 77
4.1.2.2 Konzentrationsbereich der IDO Inhibition mit Norharman 79
4.2 Zellkulturversuche 80
4.2.1 Auswirkung der IDO Inhibition auf die Zytokin Produktion durch 80
PBMC Gesamtbetrachtung
4.2.2 Zytokin Produktion durch PBMC unter Stimulation mit PHA 83
4.2.3 Zytokin Produktion unter IDO Inhibition 85
4.2.3.1 Intraindividuelle Schwankungen unter IDO Inhibition 86
4.2.3.2 Effekt unterschiedlicher Stimulationskonditionen auf die IDO 87
Inhibition
4.2.3.3 Vergleich der Reaktionen der beiden Zytokine auf IDO Inhibition 88
4.2.3.4 Weitere Einflussfaktoren auf die Zytokin Produktion unter IDO 88
Inhibition
4.3 Genetik: Zytokin Gen Polymorphismen 89
4.3.1 CA Repeat Polymorphismus des Interferon y Gens 89
4.3.2 174 G—?C Single Nucleotid Polymorphismus des Interleukin 6 Gens 90
4.4 Zusammenhang zwischen Zellkultur Ergebnissen und Genetik 91
4.4.1 Zusammenhang zwischen Zytokin Produktion und Genetik 91
4.4.1.1 IFN y Produktion und CA Repeat Polymorphismus 91
4.4.1.2 IL 6 Produktion und 174 G »C Polymorphismus des EL 6 Gens 93
4.4.2 Zusammenhang zwischen Zytokin Produktion unter IDO Inhibition 94
und Genotyp des entsprechenden Zytokin Gens
4.4.2.1 Interferon gamma 94
4.4.2.2 Interleukin 6 96
4.5 Gesamtbetrachtung und Ausblick 98
5. Zusammenfassung 99
6. Literaturverzeichnis 102
7. Anhang 117
7.1 Abkürzungen 117
7.2 Geräte und Materialien 117
7.2.1 Zellkultur: Probenverarbeitung und Zellkulturversuche 117
7.2.1.1 Geräte 117
7.2.1.2 Arbeitsgegenstände 118
7.2.1.3 Verbrauchsmaterial 119
7.2.1.4 Reagenzien 120
7.2.1.5 Chemikalien 120 •
7.2.2 ELISA Untersuchungen 120
7.2.2.1 Geräte 120
7.2.2.2 Verbrauchsmaterial 121
7.2.2.3 Reagenzien 121
7.2.2.4 Chemikalien 121
7.2.2.5 Pufferlösungen 122
7.2.3 Genetik 122
7.2.3.1 Probenverarbeitung 122
7.2.3.2 Polymerase Ketten Reaktion 122
7.2.3.3 Sequenzierung 123
7.3 Tabellen 124
7.4 Lebenslauf 126
7.5 Danksagung 126 |
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| spellingShingle | Busl, Katharina Maria 1978- Auswirkungen der IDO-Inhibition auf die In-vitro-Zytokin-Produktion peripherer mononukleärer Blutzellen einer repräsentativen Stichprobe gesunder Probanden unter Berücksichtigung der Zytokin-Gen-Polymorphismen |
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