Isolation und Charakterisierung thrombozytärer Plasma-Membranproteine:
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2006
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DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES DER
BAYERISCHEN JULIUS-MAXIMILLIANS-UNIVERSITAET WUERZBURG VORGELEGT VON DIPL.
BIOCHEMIKER JAN MOEBIUS AUS LIPPSTADT ULB DARMSTADT
ILLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL 16683310 WUERZBURG 2006 I. INHALTSVERZEICHNIS I.
INHALTSVERZEICHNIS I. INHALTSVERZEICHNIS 1 II. VEROEFFENTLICHUNGEN 5 III.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 7 IV. ZUSAMMENFASSUNG 9 V. SUMMARY 10 1.
EINLEITUNG 11 1.1. MORPHOLOGIE DER THROMBOZYTEN 11 1.2. DIE FUNKTION DER
THROMBOZYTEN IN DER HAEMOSTASE 13 1.3. THROMBOZYTAERE REZEPTOREN UND
MEMBRANPROTEINE 16 1.3.1. INTEGRINE 17 1.3.2. LEUCIN-REICHE PROTEINE 18
1.3.3. G-PROTEIN GEKOPPPELTE REZEPTOREN (GPCR) 19 1.3.4. IMMUNOGLOBULIN
REZEPTOREN 21 1.3.5. TETRASPANINE 21 1.3.6. WEITERE MEMBRANPROTEINE 22
1.4. MEMBRANMIKROSTRUKTUREN (LIPID-RAFTS) 23 1.5. PROTEOMFORSCHUNG 24
1.6. METHODEN DER PROTEOMFORSCHUNG 25 1.7. PROTEOMANALYSEN HUMANER
THROMBOZYTEN 26 2. MOTIVATION UND ZIELSETZUNGEN DIESER ARBEIT 28 3.
MATERIAL UND METHODEN 30 3.1. VERWENDETE MATERIALIEN 30 3.1.1.
CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 30 3.1.2. VERWENDETE GERAETE 33
3.1.3. ANTIKOERPER 34 -1 - I. INHALTSVERZEICHNIS 3.1.4. SELBST ERSTELLTE
ANTIKOERPER 34 3.2. MEMBRANPRAEPARATION 35 3.2.1. AUFARBEITUNG HUMANER
THROMBOZYTEN AUS VOLLBLUT UND THROMBOZYTENKONZENTRATEN 35 3.2.2.
MEMBRANPRAEPARATION MITTELS DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION....36 3.2.3.
PROTEIN-MARKIERUNG MIT BIOTIN UND STREPTAVIDIN-AUFREINIGUNG ...37 3.2.4.
MEMBRAN-PROTEINISOLATION MITTELS POLY-LYSIN AGAROSE PARTIKEL.37 3.2.5.
PRAEPARATION CHOLESTERIN-ANGREICHERTER MEMBRANBEREICHE (LIPID- RAFLS) 38
3.3. HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER 39 3.3.1. PEPTIDSYNTHESE UND
-AUFREINIGUNG 39 3.3.2. PEPTID-KOPPLUNG AN KEYHOLE LIMPET HEMOCYANIN 40
3.3.3. IMMUNISIERUNG MIT KLH-GEKOPPELTEN PEPTIDEN 41 3.3.4.
AFFINITAETSAUFREINIGUNG DER ANTIKOERPER 41 3.4. ELEKTROPHORETISCHE
PROTEINSEPARATION 43 3.4.1. BIS-TRIS SDS-PAGE 43 3.4.2. TRIS-GLYCIN
SDS-PAGE 43 3.4.3. 16-BAC-PAGE 44 3.4.4. ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG 45
3.5. DETEKTION VON PROTEINEN 47 3.5.1. KOLLOIDAL COOMASSIE G-250 47
3.5.2. SILBER-FAERBUNG 47 3.6. IMMUNODETEKTION VON PROTEINEN
(WESTERN-BLOT) 48 3.7. PROTEINIDENTIFIKATION MITTELS MASSENSPEKTROMETRIE
49 3.7.1. PROTEOLYTISCHER IN-GEL VERDAU 49 3.7.2. NANO-LC-MS 50 3.7.3.
MALDI-TOF-MS 51 3.7.4. AUTOMATISIERTE DATENAUSWERTUNG 52 4. ERGEBNISSE
53 -2- I. INHALTSVERZEICHNIS 4.1. AUFREINIGUNG HUMANER
THROMBOZYTENMEMBRANEN 53 4.2. POLY-LYSIN AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 53
4.3. MEMBRANPROTEINAUFREINIGUNG DURCH BIOTINMARKIERUNG 55 4.4.
MEMBRANPRAEPARATION MIT DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 60 4.4.1.
OPTIMIERUNG DER MEMBRANPRAEPARATION 66 4.4.2. ERGEBNISSE DER
MEMBRANPRAEPARATION NACH EINDIMENSIONALER GELELEKTROPHORESE 68 4.4.3.
SEPARATION DER MEMBRANPROTEINE MIT 16-BAC/SDS-PAGE 70 4.4.4. DETEKTION
G-PROTEIN GEKOPPELTER REZEPTOREN 73 4.5. PRAEPARATION UND ANALYSE
THROMBOZYTAERER LIPID-RAFTS 74 4.5.1. OPTIMIERUNG DER ZWEIDIMENSIONALEN
GELELEKTROPHORESE 79 4.6. GENERIERUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER GEGEN
MEMBRANPROTEINE 83 5. DISKUSSION 87 5.1. METHODEN ZUR AUFREINIGUNG
THROMBOZYTAERER MEMBRANEN 87 5.1.1. POLY-LYSIN AFFINITAETSAUFREINIGUNG 87
5.1.2. BIOTIN-MARKIERUNG VON OBERFLAECHENPROTEINEN MIT NACHFOLGENDER
STREPTAVIDIN-AFFINITAETSAUFREINIGUNG 88 5.1.3. IMMUNODETEKTION-GERICHTETE
AUFREINIGUNGSSTRATEGIE 91 5.2. MEMBRANVESIKELAUFREINIGUNG MITTELS
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 92 5.2.1. ALTERNATIVE METHODEN ZUR
MEMBRANPROTEOMANALYSE 96 5.2.2. PROTEINIDENTIFIKATION VON GPCR S 97 5.3.
ANALYSE DES LIPID-RAFT PROTEOMS HUMANER THROMBOZYTEN 100 5.4. NEUE
ANTIKOERPER GEGEN THROMBOZYTAERE OBERFLAECHENPROTEINE 105 5.5. DATENANALYSE
UND -INTERPRETATION 107 5.6. VERGLEICH MIT EXTERNEN PROTEOMSTUDIEN 110
6. DANKSAGUNG 113 7. LITERATURVERZEICHNIS 115 -3- I. INHALTSVERZEICHNIS
8. LEBENSLAUF 127 9. ANHANG 128 ANHANG A ERGEBNISSE DER
BIOTIN-AFFINITAETSREINIGUNG NACH SDS-PAGE 128 ANHANG B MEMBRANPRAEPARATION
NACH 2D-PAGE MALDI-MS-ANALYSE 133 ANHANG C ANALYSE DER
MEMBRANPRAEPARATION NACH 16-BAC/SDS-PAGE 135 ANHANG D OPTIMIERTE
MEMBRANPRAEPARATION NACH SDS-PAGE TRENNUNG 139 ANHANG E ANALYSE VON
MEMBRAN-PROTEINPROBEN NACH 16-BAC/SDS-PAGE 143 ANHANG F ERGEBNISSE DER
ANALYSE DES LIPID-RAFT PROTEOMS 151 ANHANG G 2D-PAGE BASIERTE TRENNUNG
DER LIPID-RAFTS PRAEPARATION 160 -4-
|
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ISOLATION UND CHARAKTERISIERUNG THROMBOZYTAERER PLASMA-MEMBRANPROTEINE
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES DER
BAYERISCHEN JULIUS-MAXIMILLIANS-UNIVERSITAET WUERZBURG VORGELEGT VON DIPL.
BIOCHEMIKER JAN MOEBIUS AUS LIPPSTADT ULB DARMSTADT
ILLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL 16683310 WUERZBURG 2006 I. INHALTSVERZEICHNIS I.
INHALTSVERZEICHNIS I. INHALTSVERZEICHNIS 1 II. VEROEFFENTLICHUNGEN 5 III.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 7 IV. ZUSAMMENFASSUNG 9 V. SUMMARY 10 1.
EINLEITUNG 11 1.1. MORPHOLOGIE DER THROMBOZYTEN 11 1.2. DIE FUNKTION DER
THROMBOZYTEN IN DER HAEMOSTASE 13 1.3. THROMBOZYTAERE REZEPTOREN UND
MEMBRANPROTEINE 16 1.3.1. INTEGRINE 17 1.3.2. LEUCIN-REICHE PROTEINE 18
1.3.3. G-PROTEIN GEKOPPPELTE REZEPTOREN (GPCR) 19 1.3.4. IMMUNOGLOBULIN
REZEPTOREN 21 1.3.5. TETRASPANINE 21 1.3.6. WEITERE MEMBRANPROTEINE 22
1.4. MEMBRANMIKROSTRUKTUREN (LIPID-RAFTS) 23 1.5. PROTEOMFORSCHUNG 24
1.6. METHODEN DER PROTEOMFORSCHUNG 25 1.7. PROTEOMANALYSEN HUMANER
THROMBOZYTEN 26 2. MOTIVATION UND ZIELSETZUNGEN DIESER ARBEIT 28 3.
MATERIAL UND METHODEN 30 3.1. VERWENDETE MATERIALIEN 30 3.1.1.
CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 30 3.1.2. VERWENDETE GERAETE 33
3.1.3. ANTIKOERPER 34 -1 - I. INHALTSVERZEICHNIS 3.1.4. SELBST ERSTELLTE
ANTIKOERPER 34 3.2. MEMBRANPRAEPARATION 35 3.2.1. AUFARBEITUNG HUMANER
THROMBOZYTEN AUS VOLLBLUT UND THROMBOZYTENKONZENTRATEN 35 3.2.2.
MEMBRANPRAEPARATION MITTELS DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION.36 3.2.3.
PROTEIN-MARKIERUNG MIT BIOTIN UND STREPTAVIDIN-AUFREINIGUNG .37 3.2.4.
MEMBRAN-PROTEINISOLATION MITTELS POLY-LYSIN AGAROSE PARTIKEL.37 3.2.5.
PRAEPARATION CHOLESTERIN-ANGREICHERTER MEMBRANBEREICHE (LIPID- RAFLS) 38
3.3. HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER 39 3.3.1. PEPTIDSYNTHESE UND
-AUFREINIGUNG 39 3.3.2. PEPTID-KOPPLUNG AN KEYHOLE LIMPET HEMOCYANIN 40
3.3.3. IMMUNISIERUNG MIT KLH-GEKOPPELTEN PEPTIDEN 41 3.3.4.
AFFINITAETSAUFREINIGUNG DER ANTIKOERPER 41 3.4. ELEKTROPHORETISCHE
PROTEINSEPARATION 43 3.4.1. BIS-TRIS SDS-PAGE 43 3.4.2. TRIS-GLYCIN
SDS-PAGE 43 3.4.3. 16-BAC-PAGE 44 3.4.4. ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG 45
3.5. DETEKTION VON PROTEINEN 47 3.5.1. KOLLOIDAL COOMASSIE G-250 47
3.5.2. SILBER-FAERBUNG 47 3.6. IMMUNODETEKTION VON PROTEINEN
(WESTERN-BLOT) 48 3.7. PROTEINIDENTIFIKATION MITTELS MASSENSPEKTROMETRIE
49 3.7.1. PROTEOLYTISCHER IN-GEL VERDAU 49 3.7.2. NANO-LC-MS 50 3.7.3.
MALDI-TOF-MS 51 3.7.4. AUTOMATISIERTE DATENAUSWERTUNG 52 4. ERGEBNISSE
53 -2- I. INHALTSVERZEICHNIS 4.1. AUFREINIGUNG HUMANER
THROMBOZYTENMEMBRANEN 53 4.2. POLY-LYSIN AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 53
4.3. MEMBRANPROTEINAUFREINIGUNG DURCH BIOTINMARKIERUNG 55 4.4.
MEMBRANPRAEPARATION MIT DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 60 4.4.1.
OPTIMIERUNG DER MEMBRANPRAEPARATION 66 4.4.2. ERGEBNISSE DER
MEMBRANPRAEPARATION NACH EINDIMENSIONALER GELELEKTROPHORESE 68 4.4.3.
SEPARATION DER MEMBRANPROTEINE MIT 16-BAC/SDS-PAGE 70 4.4.4. DETEKTION
G-PROTEIN GEKOPPELTER REZEPTOREN 73 4.5. PRAEPARATION UND ANALYSE
THROMBOZYTAERER LIPID-RAFTS 74 4.5.1. OPTIMIERUNG DER ZWEIDIMENSIONALEN
GELELEKTROPHORESE 79 4.6. GENERIERUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER GEGEN
MEMBRANPROTEINE 83 5. DISKUSSION 87 5.1. METHODEN ZUR AUFREINIGUNG
THROMBOZYTAERER MEMBRANEN 87 5.1.1. POLY-LYSIN AFFINITAETSAUFREINIGUNG 87
5.1.2. BIOTIN-MARKIERUNG VON OBERFLAECHENPROTEINEN MIT NACHFOLGENDER
STREPTAVIDIN-AFFINITAETSAUFREINIGUNG 88 5.1.3. IMMUNODETEKTION-GERICHTETE
AUFREINIGUNGSSTRATEGIE 91 5.2. MEMBRANVESIKELAUFREINIGUNG MITTELS
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 92 5.2.1. ALTERNATIVE METHODEN ZUR
MEMBRANPROTEOMANALYSE 96 5.2.2. PROTEINIDENTIFIKATION VON GPCR'S 97 5.3.
ANALYSE DES LIPID-RAFT PROTEOMS HUMANER THROMBOZYTEN 100 5.4. NEUE
ANTIKOERPER GEGEN THROMBOZYTAERE OBERFLAECHENPROTEINE 105 5.5. DATENANALYSE
UND -INTERPRETATION 107 5.6. VERGLEICH MIT EXTERNEN PROTEOMSTUDIEN 110
6. DANKSAGUNG 113 7. LITERATURVERZEICHNIS 115 -3- I. INHALTSVERZEICHNIS
8. LEBENSLAUF 127 9. ANHANG 128 ANHANG A ERGEBNISSE DER
BIOTIN-AFFINITAETSREINIGUNG NACH SDS-PAGE 128 ANHANG B MEMBRANPRAEPARATION
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MEMBRANPRAEPARATION NACH 16-BAC/SDS-PAGE 135 ANHANG D OPTIMIERTE
MEMBRANPRAEPARATION NACH SDS-PAGE TRENNUNG 139 ANHANG E ANALYSE VON
MEMBRAN-PROTEINPROBEN NACH 16-BAC/SDS-PAGE 143 ANHANG F ERGEBNISSE DER
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