Das Onkolytische Potenzial von Adenovirus Typ 5:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungen V
1 Zusammenfassung 1
2 Einleitung 3
2.1 Adenoviren 3
2.1.1 Klassifizierung 3
2.1.2 Struktur und Genomorganisation 4
2.1.3 Produktiver Infektionszyklus 6
2.2 Virotherapiemit humanen Adenoviren 8
2.3 Gliome 10
2.4 Aufgabenstellung 12
3 Material 15
3.1 Säugerzelllinien 15
3.2 Adenoviren 16
3.3 Versuchstiere 16
3.4 Antikörper 7
3.4.1 Primärantikörper )7
3.4.2 Sekundärantikörper 17
3.5 Chemikalien. Reagenzien und Verbrauchsmaterial 18
3.6 Kommerzielle Systeme 8
3.7 Größen und Molekulargewichtstandards 18
3.8 Computerprogramme und Datenbanken 8
I
4 Methoden 20
4.1 Gewebekultur 20
4.1.1 Vermehrung und Aufbewahrung von Zellen 20
4.1.2 Lagerung von Säugerzellen 21
4.1.3 Bestimmung der Gesamt Zellzahl 21
4.1.4 Zellernte 22
4.1.5 Zellaufschluss und Gewinnung von Gesamtzellextrakt 22
4.1.6 Fixierung mit Methanol 23
4.2 Adenoviren 23
4.2.1 Gewinnung von Virus aus Bacmid DNA 23
4.2.2 Multiplizität der Infektion (mulliplicity ofinfection m.o.i) 24
4.2.3 Infektion von Säugerzellen mit Adenoviren 24
4.2.4 Herstellung und Lagerung von hochtitrigen Virusstocks 25
4.2.5 Aufreinigung in der Dialyse und Herstellung von PBS Virusstocks 26
4.2.6 Titerbestimmung von Virusstocks 27
4.2.7 Bestimmung der Ausbeute an Virusnachkommen 28
4.3 Protein Techniken 29
4.3.1 Quantitative Bestimmung von Proteinkonzentrationen 29
4.3.2 SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS PAGE) 30
4.3.3 Western Blot 32
4.4 DNA Techniken 34
4.4.1 DNA Agarose Gelelektrophorese 34
4.4.2 Polymerase Ketten Reaktion (PCR) 35
4.4.3 DNA Sequenzierung 35
4.5 Nachweis des Zellüberlebens 36
4.5.1 Mikroplate Titer Assay (MTT Assay) 36
4.5.2 Trypanblau Färbung 37
4.5.3 Kristallviolett Färbung 37
4.5.4 Fluorescinediacetate Färbung(FDA) 38
II
4.6 Tierexperimentelle Arbeiten 39
4.6.1 Implantation von Tumorgewebe 39
4.6.2 Injektion der Viren in Mäuse 40
4.6.3 Histopathologie 40
5 Laborexperimentelle Ergebnisse 41
5.1 Charakterisierung der Zelllinien 41
5.1.1 Überprüfung auf Mykoplasmenkontamination 41
5.1.2 Transduzierbarkeit mit AdGFP 42
5.2 Klonierungssystem zur Herstellung von Adenovirusmutanten 44
5.3 Übersicht der verwendeten Virusmutanten 46
5.4 Charakterisierung der Virusmutanten 47
5.4.1 Expression des ElB 55kDa Proteins im Verlauf der Virusinfektion 48
5.4.2 Expression viraler Strukturproteine im Verlauf der Virusinfektion 49
5.4.3 Expression des L4 100k Proteins im Verlauf der Virusinfektion 51
5.4.4 Produktion von Nachkommenviren 52
5.4.5 Zusammenfassung I 55
5.5 Einfluss der Mutationen auf die onkolytische Aktivität 56
5.5.1 MTT Assay 56
5.5.2 Trypanblau Färbung 57
5.5.3 Kristallviolett Färbung 58
5.5.4 Fluorescinediacetate Versuch 60
5.5.4.1 Fluorescinediacetate Versuch in Tumorzelllinien 61
5.5.4.2 Fluorescinediacetate Versuch in Amniocyten 63
5.5.5 Zusammenfassung II 64
6 Tierexperimentelle Ergebnisse 66
6.1 Allgemeine Überlegungen 66
6.2 Onkolytischer Effekt im Tiermodell 67
6.2.1 Versuchsaufbau 67
III
6.2.2 Onkolytische Effizienz von verschiedenen Adenoviren in vivo 68
6.2.2.1 Änderung des Gewichts der Nacktmäusen 68
6.2.2.2 Änderung der Tumorfläche in den Nacktmäusen 70
6.3 Histologischer Befund 74
6.3.1 Histologischer Befund des Glioblastoms 74
6.3.2 Histologischer Befund der Organe 77
7 Diskussion 80
7.1 Onkolytisches Potenzial von Viren 80
7.1.1 Historischer Rückblick 80
7.1.2 Onkolysefähige Viren 81
7.2 Etablierung eines In vitro Selektionsverfahrens zur Auswahl effizienter
onkolytischer Virusmutanten 83
7.3 Adenovirale Mutanten 86
7.4 Ausblick: Tumortherapie in Zukunft 89
8 Literaturverzeichnis 92
Veröffentlichungen 104
Danksagung 105
Erklärung zum Promotionsverfahren 107
Curriculum Vitae 108
IV
|
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungen V
1 Zusammenfassung 1
2 Einleitung 3
2.1 Adenoviren 3
2.1.1 Klassifizierung 3
2.1.2 Struktur und Genomorganisation 4
2.1.3 Produktiver Infektionszyklus 6
2.2 Virotherapiemit humanen Adenoviren 8
2.3 Gliome 10
2.4 Aufgabenstellung 12
3 Material 15
3.1 Säugerzelllinien 15
3.2 Adenoviren 16
3.3 Versuchstiere 16
3.4 Antikörper '7
3.4.1 Primärantikörper )7
3.4.2 Sekundärantikörper 17
3.5 Chemikalien. Reagenzien und Verbrauchsmaterial 18
3.6 Kommerzielle Systeme '8
3.7 Größen und Molekulargewichtstandards 18
3.8 Computerprogramme und Datenbanken '8
I
4 Methoden 20
4.1 Gewebekultur 20
4.1.1 Vermehrung und Aufbewahrung von Zellen 20
4.1.2 Lagerung von Säugerzellen 21
4.1.3 Bestimmung der Gesamt Zellzahl 21
4.1.4 Zellernte 22
4.1.5 Zellaufschluss und Gewinnung von Gesamtzellextrakt 22
4.1.6 Fixierung mit Methanol 23
4.2 Adenoviren 23
4.2.1 Gewinnung von Virus aus Bacmid DNA 23
4.2.2 Multiplizität der Infektion (mulliplicity ofinfection m.o.i) 24
4.2.3 Infektion von Säugerzellen mit Adenoviren 24
4.2.4 Herstellung und Lagerung von hochtitrigen Virusstocks 25
4.2.5 Aufreinigung in der Dialyse und Herstellung von PBS Virusstocks 26
4.2.6 Titerbestimmung von Virusstocks 27
4.2.7 Bestimmung der Ausbeute an Virusnachkommen 28
4.3 Protein Techniken 29
4.3.1 Quantitative Bestimmung von Proteinkonzentrationen 29
4.3.2 SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS PAGE) 30
4.3.3 Western Blot 32
4.4 DNA Techniken 34
4.4.1 DNA Agarose Gelelektrophorese 34
4.4.2 Polymerase Ketten Reaktion (PCR) 35
4.4.3 DNA Sequenzierung 35
4.5 Nachweis des Zellüberlebens 36
4.5.1 Mikroplate Titer Assay (MTT Assay) 36
4.5.2 Trypanblau Färbung 37
4.5.3 Kristallviolett Färbung 37
4.5.4 Fluorescinediacetate Färbung(FDA) 38
II
4.6 Tierexperimentelle Arbeiten 39
4.6.1 Implantation von Tumorgewebe 39
4.6.2 Injektion der Viren in Mäuse 40
4.6.3 Histopathologie 40
5 Laborexperimentelle Ergebnisse 41
5.1 Charakterisierung der Zelllinien 41
5.1.1 Überprüfung auf Mykoplasmenkontamination 41
5.1.2 Transduzierbarkeit mit AdGFP 42
5.2 Klonierungssystem zur Herstellung von Adenovirusmutanten 44
5.3 Übersicht der verwendeten Virusmutanten 46
5.4 Charakterisierung der Virusmutanten 47
5.4.1 Expression des ElB 55kDa Proteins im Verlauf der Virusinfektion 48
5.4.2 Expression viraler Strukturproteine im Verlauf der Virusinfektion 49
5.4.3 Expression des L4 100k Proteins im Verlauf der Virusinfektion 51
5.4.4 Produktion von Nachkommenviren 52
5.4.5 Zusammenfassung I 55
5.5 Einfluss der Mutationen auf die onkolytische Aktivität 56
5.5.1 MTT Assay 56
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5.5.4 Fluorescinediacetate Versuch 60
5.5.4.1 Fluorescinediacetate Versuch in Tumorzelllinien 61
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5.5.5 Zusammenfassung II 64
6 Tierexperimentelle Ergebnisse 66
6.1 Allgemeine Überlegungen 66
6.2 Onkolytischer Effekt im Tiermodell 67
6.2.1 Versuchsaufbau 67
III
6.2.2 Onkolytische Effizienz von verschiedenen Adenoviren in vivo 68
6.2.2.1 Änderung des Gewichts der Nacktmäusen 68
6.2.2.2 Änderung der Tumorfläche in den Nacktmäusen 70
6.3 Histologischer Befund 74
6.3.1 Histologischer Befund des Glioblastoms 74
6.3.2 Histologischer Befund der Organe 77
7 Diskussion 80
7.1 Onkolytisches Potenzial von Viren 80
7.1.1 Historischer Rückblick 80
7.1.2 Onkolysefähige Viren 81
7.2 Etablierung eines In vitro Selektionsverfahrens zur Auswahl effizienter
onkolytischer Virusmutanten 83
7.3 Adenovirale Mutanten 86
7.4 Ausblick: Tumortherapie in Zukunft 89
8 Literaturverzeichnis 92
Veröffentlichungen 104
Danksagung 105
Erklärung zum Promotionsverfahren 107
Curriculum Vitae 108
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