Untersuchungen zur Funktion und Expression von antimikrobiellen Peptiden in der Bovinen Milchdrüse:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Kiel
Selbstverl. des Inst. für Tierzucht und Tierhaltung der Christian-Albrechts-Univ. zu Kiel
2007
|
| Schriftenreihe: | Schriftenreihe des Instituts für Tierzucht und Tierhaltung der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
160 |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis...................................................................................................I
Verzeichnis der Abbildungen................................................................................III
Verzeichnis der Tabellen......................................................................................VI
Verzeichnis der Abkürzungen..............................................................................VII
1. Einleitung...................................................................................................................1
2. Literaturübersicht......................................................................................................3
2.1 Das bovine Euter..............................................................................................3
2.1.1 Die makroskopische Anatomie der Milchdrüse....................................3
2.1.2 Die mikroskopische Anatomie der Milchdrüse.....................................5
2.1.3 Die Bedeutung der Mastitis.....................................................................7
2.1.4 Mastitis und ß-Defensine.........................................................................8
2.2 Epitheliales Gewebe als erste Barriere gegen pathogene Erreger........10
2.3 Das Immunsystem..........................................................................................11
2.4 Antimikrobielle Peptide..................................................................................18
2.4.1 Struktur antimikrobieller Peptide..........................................................19
2.4.2 Wirkungsweise antimikrobieller Peptide.............................................21
2.4.3 ß-Defensine.............................................................................................23
2.4.4 Humane ß-Defensine.............................................................................25
2.4.5 Bovine ß-Defensine................................................................................26
2.4.6 Defensinkartierung beim Rind..............................................................29
2.4.7 Das S100A7-Protein (Psoriasin)..........................................................31
2.5 Die Expression von ß-Defensinen................................................................34
2.6 Induzierbarkeit antimikrobieller Peptide......................................................37
3. Material und Methoden..........................................................................................39
3.1 Material.............................................................................................................40
3.2 Methoden.........................................................................................................56
3.3 Kultivierung eukaryotischer Zellen...............................................................59
3.4 Anzucht und Aufarbeitung der Bakterienkulturen......................................63
3.5 Expressionsanalyse.......................................................................................64
3.6 Quantifizierung................................................................................................68
4. Ergebnisse...............................................................................................................75
4.1 Expressionsanalyse in der Milchdrüse........................................................75
4.2 Expressionsanalyse in der Zellkultur...........................................................78
4.3 Quantifizierung der Ergebnisse aus den Eutergewebeproben................81
4.3.1 Quantifizierung der Eutergewebeproben aus dem Schlachthof......81
4.3.2 Quantifizierung der Eutergewebeproben aus Dummerstorf............97
4.3.3 Zusammenfassung der Ergebnisse aus den Eutergewebeproben
102
4.4 Quantifizierung der Ergebnisse aus dem Infektionsversuch.................103
4.5 Ergebnisse aus den MASnet-Proben........................................................108
4.6 Ergebnisse der Quantifizierungen aus den Zellkulturen.........................113
5. Diskussion..............................................................................................................121
5.1 Einfluss der Mastitis auf die Expression von antimikrobietlen Peptiden in
der Milchdrüse...............................................................................................121
5.2 Expression antimikrobieller Peptide in der Milchdrüse in Abhängigkeit
spezifischer Erreger.....................................................................................123
Inhaltsverzeichnis
5.3 Tierindividuelle Unterschiede in der Höhe der Expression
antimikrobieller Peptide...............................................................................125
5.4 Einfluss der Dauer der Infektion auf die Expression antimikrobieller
Peptide in der Milchdrüse............................................................................127
5.5 Ort der Expression in der Milchdrüse........................................................128
5.6 Diskussion der Ergebnisse aus der MAC-T Zelllinie...............................131
5.7 Diskussion der Ergebnisse aus der primären Zellkultur.........................133
5.8 Perspektive....................................................................................................134
6. Zusammenfassung...............................................................................................139
7. Summary................................................................................................................141
8. Literaturverzeichnis..............................................................................................143
9. Anhang...................................................................................................................158
-II-
Verzeichnis der Abbildungen
Verzeichnis der Abbildungen
Die bovine Milchdrüse 3
Anatomie der Zitze 5
Schematische Darstellung der potentiellen Aktivitäts-
Mechanismen antimikrobieller Peptide im adaptiven
Immunsystem 15
Genomische Struktur eines ß-Defensins 21
Wirkungsweise antimikrobieller Peptide 22
Contig A 30
Contig B 31
Psoriasin 34
Darstellung der molekulargenetischen Labrarbeiten 40
Ort der Probenentnahme 57
Ablauf der rechnerischen Quantifizierung 73
Expressionsprofil der Eutergewebes 77
Expression der 300Fam in gesundem Eutergewebe 77
Expressionsprofil in der Zellkultur 79
Expression der 300Fam in der Zellkultur 79
Konzentration LAP im Probenmaterial BB I 82
Konzentration TAP im Probenmaterial BB I 83
Konzentration EBD im Probenmaterial BB I 83
Konzentration BNBD4 im Probenmaterial BB I 84
Konzentration BNBD10 im Probenmaterial BB I 85
Konzentration LAP im Probenmaterial BB II 86
Konzentration TAP im Probenmaterial BB II 87
Konzentration EBD im Probenmaterial BB II 88
Konzentration 300Fam im Probenmaterial BB II 88
Konzentration LAP im Probenmaterial BB III 90
Konzentration TAP im Probenmaterial BB III 90
Konzentration EBD im Probenmaterial BB III 91
Konzentration 300Fam im Probenmaterial BB III 92
Konzentration BNBD4 im Probenmaterial BB III 93
Konzentration BNBD10 im Probenmaterial BB III 93
-iii-
Abb. 1:
Abb. 2:
Abb. 3:
Abb. 4
Abb. 5
Abb. 6
Abb. 7
Abb. 8
Abb. 9
Abb. 10
Abb. 11
Abb. 12
Abb. 13
Abb. 14
Abb. 15
Abb. 16
Abb. 17
Abb. 18
Abb. 19
Abb. 20
Abb. 21
Abb. 22
Abb. 23
Abb. 24
Abb. 25
Abb. 26
Abb. 27
Abb. 28
Abb. 29
Abb. 30
Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 31 Konzentration LAP im Probenmaterial BBIV 95
Abb. 32 Konzentration TAP im Probenmaterial BB IV 96
Abb. 33 Konzentration EBD im Probenmaterial BB IV 96
Abb. 34 Konzentration 300Fam im Probenmaterial BB IV 97
Abb. 35 Konzentration BNBD4 im Probenmaterial BB IV 98
Abb. 36 Konzentration BNBD 10 im Probenmaterial BB IV 98
Abb. 37 Konzentration LAP im Probenmaterial aus Dummerstorf 100
Abb. 38 Konzentration TAP im Probenmaterial aus Dummerstorf 100
Abb. 39 Konzentration EBD im Probenmaterial aus Dummerstorf 101
Abb. 40 Konzentration 300Fam im Probenmaterial aus Dummerstorf 101
Abb. 41 Konzentration BNBD4 im Probenmaterial aus Dummerstorf 102
Abb. 42 Konzentration BNBD10 im Probenmaterial aus Dummerstorf 103
Abb. 43 Konzentration Psoriasin im Probenmaterial aus Dummerstorf 104
Abb. 44 Konzentration LAP im Infektionsversuch 106
Abb. 45 Konzentration TAP im Infektionsversuch 107
Abb. 46 Konzentration EBD im Infektionsversuch 107
Abb. 47 Konzentration 300Fam im Infektionsversuch 108
Abb. 48 Konzentration BNBD4 im Infektionsversuch 109
Abb. 49 Konzentration BNBD10 im Infektionsversuch 110
Abb. 50 Konzentration LAP in den MASnet-Proben 112
Abb. 51 Konzentration TAP in den MASnet-Proben 113
Abb. 52 Konzentration EBD in den MASnet-Proben 114
Abb. 53 Konzentration 300Fam in den MASnet-Proben 115
Abb. 54 Konzentration BNBD4 in den MASnet-Proben 115
Abb. 55 Konzentration BNBD10 in den MASnet-Proben 116
Abb. 56 Konzentration Psoriasin in den MASnet-Proben 117
Abb. 57 Amplif ication Chart EBD 119
Abb. 58 Konzentration LAP in den Zellen der primären Zelllinie 120
Abb. 59 Konzentration TAP in den Zelten der primären Zelllinie 121
Abb. 60 Konzentration EBD in den Zellen der primären Zelllinie 121
Abb. 61 Konzentration 300Fam in den Zellen der primären Zelllinie 122
Abb. 62 Konzentration BNBD10 in den Zellen der primären Zelllinie 123
Abb. 63 Konzentration Psoriasin in den Zellen der primären Zetliinie 124
-IV-
Verzeichnis der Abbildungen
Verzeichnis der Abbildungen im Anhang
Abb. 1A Schmelzkurve GAPDH 157
Abb. 2A Schmelzkurve LAP 157
Abb. 3A Schmelzkurve TAP 158
Abb. 4A Schmelzkurve EBD 158
Abb. 5A Schmelzkurve 300Fam 159
Abb. 6A Schmelzkurve BNBD4 159
Abb.7A Schmelzkurve BNBD10 160
Abb. 8A Schmelzkurve Psoriasin 160
-V-
Verzeichnis der Tabellen
Verzeichnis der Tabellen
Tab. 1 Faktoren im Mastitisgeschehen 7
Tab. 2 Abwehrmechanismen des Euters 16
Tab. 3 Strukturmerkrnale antimkrobieller Peptide 19
Tab. 4 Expression von ß-Defensinen im bovinen Gewebe 27
Tab. 5 Gewebeproben mit unterschiedlichem Gesundheitsstatus 29
Tab. 6 Verwendete Primer mit Sequenzangabe und Name 42
Tab. 7 In den Stimulationsversuchen verwendete Bakterienstämme 45
Tab. 8 Probenmaterial des Stimulationsversuches 46
Tab. 9 Probenmaterial des zeitkinetischen Versuches 47
Tab. 10 Probenmaterial der primären Zellkultur 48
Tab. 11 BBI Euterproben vom 13. u. 14.12.04 49
Tab. 12 BB II Euterproen vom 29.06.06 50
Tab. 13 BB III Euterproben vom 26.07.06 51
Tab. 14 BB IV Euterproben vom 29.08.06 52
Tab. 15 Euterproben Dummerstorf / FBN 53/54
Tab. 16 Infektionsversuch 55
Tab. 17 MASnet Proben 56
Tab. 18 PCR-Ergebnisse auf cDNA 76
Tab. 19 PCR-Ergebnisse auf cDNA aus der Zellkultur 78
|
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis.I
Verzeichnis der Abbildungen.III
Verzeichnis der Tabellen.VI
Verzeichnis der Abkürzungen.VII
1. Einleitung.1
2. Literaturübersicht.3
2.1 Das bovine Euter.3
2.1.1 Die makroskopische Anatomie der Milchdrüse.3
2.1.2 Die mikroskopische Anatomie der Milchdrüse.5
2.1.3 Die Bedeutung der Mastitis.7
2.1.4 Mastitis und ß-Defensine.8
2.2 Epitheliales Gewebe als erste Barriere gegen pathogene Erreger.10
2.3 Das Immunsystem.11
2.4 Antimikrobielle Peptide.18
2.4.1 Struktur antimikrobieller Peptide.19
2.4.2 Wirkungsweise antimikrobieller Peptide.21
2.4.3 ß-Defensine.23
2.4.4 Humane ß-Defensine.25
2.4.5 Bovine ß-Defensine.26
2.4.6 Defensinkartierung beim Rind.29
2.4.7 Das S100A7-Protein (Psoriasin).31
2.5 Die Expression von ß-Defensinen.34
2.6 Induzierbarkeit antimikrobieller Peptide.37
3. Material und Methoden.39
3.1 Material.40
3.2 Methoden.56
3.3 Kultivierung eukaryotischer Zellen.59
3.4 Anzucht und Aufarbeitung der Bakterienkulturen.63
3.5 Expressionsanalyse.64
3.6 Quantifizierung.68
4. Ergebnisse.75
4.1 Expressionsanalyse in der Milchdrüse.75
4.2 Expressionsanalyse in der Zellkultur.78
4.3 Quantifizierung der Ergebnisse aus den Eutergewebeproben.81
4.3.1 Quantifizierung der Eutergewebeproben aus dem Schlachthof.81
4.3.2 Quantifizierung der Eutergewebeproben aus Dummerstorf.97
4.3.3 Zusammenfassung der Ergebnisse aus den Eutergewebeproben
102
4.4 Quantifizierung der Ergebnisse aus dem Infektionsversuch.103
4.5 Ergebnisse aus den MASnet-Proben.108
4.6 Ergebnisse der Quantifizierungen aus den Zellkulturen.113
5. Diskussion.121
5.1 Einfluss der Mastitis auf die Expression von antimikrobietlen Peptiden in
der Milchdrüse.121
5.2 Expression antimikrobieller Peptide in der Milchdrüse in Abhängigkeit
spezifischer Erreger.123
Inhaltsverzeichnis
5.3 Tierindividuelle Unterschiede in der Höhe der Expression
antimikrobieller Peptide.125
5.4 Einfluss der Dauer der Infektion auf die Expression antimikrobieller
Peptide in der Milchdrüse.127
5.5 Ort der Expression in der Milchdrüse.128
5.6 Diskussion der Ergebnisse aus der MAC-T Zelllinie.131
5.7 Diskussion der Ergebnisse aus der primären Zellkultur.133
5.8 Perspektive.134
6. Zusammenfassung.139
7. Summary.141
8. Literaturverzeichnis.143
9. Anhang.158
-II-
Verzeichnis der Abbildungen
Verzeichnis der Abbildungen
Die bovine Milchdrüse 3
Anatomie der Zitze 5
Schematische Darstellung der potentiellen Aktivitäts-
Mechanismen antimikrobieller Peptide im adaptiven
Immunsystem 15
Genomische Struktur eines ß-Defensins 21
Wirkungsweise antimikrobieller Peptide 22
Contig A 30
Contig B 31
Psoriasin 34
Darstellung der molekulargenetischen Labrarbeiten 40
Ort der Probenentnahme 57
Ablauf der rechnerischen Quantifizierung 73
Expressionsprofil der Eutergewebes 77
Expression der 300Fam in gesundem Eutergewebe 77
Expressionsprofil in der Zellkultur 79
Expression der 300Fam in der Zellkultur 79
Konzentration LAP im Probenmaterial BB I 82
Konzentration TAP im Probenmaterial BB I 83
Konzentration EBD im Probenmaterial BB I 83
Konzentration BNBD4 im Probenmaterial BB I 84
Konzentration BNBD10 im Probenmaterial BB I 85
Konzentration LAP im Probenmaterial BB II 86
Konzentration TAP im Probenmaterial BB II 87
Konzentration EBD im Probenmaterial BB II 88
Konzentration 300Fam im Probenmaterial BB II 88
Konzentration LAP im Probenmaterial BB III 90
Konzentration TAP im Probenmaterial BB III 90
Konzentration EBD im Probenmaterial BB III 91
Konzentration 300Fam im Probenmaterial BB III 92
Konzentration BNBD4 im Probenmaterial BB III 93
Konzentration BNBD10 im Probenmaterial BB III 93
-iii-
Abb. 1:
Abb. 2:
Abb. 3:
Abb. 4
Abb. 5
Abb. 6
Abb. 7
Abb. 8
Abb. 9
Abb. 10
Abb. 11
Abb. 12
Abb. 13
Abb. 14
Abb. 15
Abb. 16
Abb. 17
Abb. 18
Abb. 19
Abb. 20
Abb. 21
Abb. 22
Abb. 23
Abb. 24
Abb. 25
Abb. 26
Abb. 27
Abb. 28
Abb. 29
Abb. 30
Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 31 Konzentration LAP im Probenmaterial BBIV 95
Abb. 32 Konzentration TAP im Probenmaterial BB IV 96
Abb. 33 Konzentration EBD im Probenmaterial BB IV 96
Abb. 34 Konzentration 300Fam im Probenmaterial BB IV 97
Abb. 35 Konzentration BNBD4 im Probenmaterial BB IV 98
Abb. 36 Konzentration BNBD 10 im Probenmaterial BB IV 98
Abb. 37 Konzentration LAP im Probenmaterial aus Dummerstorf 100
Abb. 38 Konzentration TAP im Probenmaterial aus Dummerstorf 100
Abb. 39 Konzentration EBD im Probenmaterial aus Dummerstorf 101
Abb. 40 Konzentration 300Fam im Probenmaterial aus Dummerstorf 101
Abb. 41 Konzentration BNBD4 im Probenmaterial aus Dummerstorf 102
Abb. 42 Konzentration BNBD10 im Probenmaterial aus Dummerstorf 103
Abb. 43 Konzentration Psoriasin im Probenmaterial aus Dummerstorf 104
Abb. 44 Konzentration LAP im Infektionsversuch 106
Abb. 45 Konzentration TAP im Infektionsversuch 107
Abb. 46 Konzentration EBD im Infektionsversuch 107
Abb. 47 Konzentration 300Fam im Infektionsversuch 108
Abb. 48 Konzentration BNBD4 im Infektionsversuch 109
Abb. 49 Konzentration BNBD10 im Infektionsversuch 110
Abb. 50 Konzentration LAP in den MASnet-Proben 112
Abb. 51 Konzentration TAP in den MASnet-Proben 113
Abb. 52 Konzentration EBD in den MASnet-Proben 114
Abb. 53 Konzentration 300Fam in den MASnet-Proben 115
Abb. 54 Konzentration BNBD4 in den MASnet-Proben 115
Abb. 55 Konzentration BNBD10 in den MASnet-Proben 116
Abb. 56 Konzentration Psoriasin in den MASnet-Proben 117
Abb. 57 Amplif ication Chart EBD 119
Abb. 58 Konzentration LAP in den Zellen der primären Zelllinie 120
Abb. 59 Konzentration TAP in den Zelten der primären Zelllinie 121
Abb. 60 Konzentration EBD in den Zellen der primären Zelllinie 121
Abb. 61 Konzentration 300Fam in den Zellen der primären Zelllinie 122
Abb. 62 Konzentration BNBD10 in den Zellen der primären Zelllinie 123
Abb. 63 Konzentration Psoriasin in den Zellen der primären Zetliinie 124
-IV-
Verzeichnis der Abbildungen
Verzeichnis der Abbildungen im Anhang
Abb. 1A Schmelzkurve GAPDH 157
Abb. 2A Schmelzkurve LAP 157
Abb. 3A Schmelzkurve TAP 158
Abb. 4A Schmelzkurve EBD 158
Abb. 5A Schmelzkurve 300Fam 159
Abb. 6A Schmelzkurve BNBD4 159
Abb.7A Schmelzkurve BNBD10 160
Abb. 8A Schmelzkurve Psoriasin 160
-V-
Verzeichnis der Tabellen
Verzeichnis der Tabellen
Tab. 1 Faktoren im Mastitisgeschehen 7
Tab. 2 Abwehrmechanismen des Euters 16
Tab. 3 Strukturmerkrnale antimkrobieller Peptide 19
Tab. 4 Expression von ß-Defensinen im bovinen Gewebe 27
Tab. 5 Gewebeproben mit unterschiedlichem Gesundheitsstatus 29
Tab. 6 Verwendete Primer mit Sequenzangabe und Name 42
Tab. 7 In den Stimulationsversuchen verwendete Bakterienstämme 45
Tab. 8 Probenmaterial des Stimulationsversuches 46
Tab. 9 Probenmaterial des zeitkinetischen Versuches 47
Tab. 10 Probenmaterial der primären Zellkultur 48
Tab. 11 BBI Euterproben vom 13. u. 14.12.04 49
Tab. 12 BB II Euterproen vom 29.06.06 50
Tab. 13 BB III Euterproben vom 26.07.06 51
Tab. 14 BB IV Euterproben vom 29.08.06 52
Tab. 15 Euterproben Dummerstorf / FBN 53/54
Tab. 16 Infektionsversuch 55
Tab. 17 MASnet Proben 56
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| dewey-tens | 630 - Agriculture and related technologies |
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