Analyse der cag-Pathogenitätsinsel verschiedener klinischer Helicobacter pylori-Isolate:
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2007
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|---|---|
| adam_text | Eidesstattliche Erklärung II
1 Abkürzungsverzeichnis IV
2 Einleitung 1
2.1 Allgemeines und Geschichte 1
2.2 Infektiologie und Epidemiologie 3
2.3 Diagnostik und Therapie 5
2.4 Pathogenese und Pathogenität 8
2.5 Zielsetzung und allgemeine Vorgehensweise 21
3 Material und Methoden 22
3.1 Helicobacter pylori 22
3.1.1 Stämme 22
3.1.2 Kultivierung 22
3.2 Zellkultur 23
3.3 Infektionsversuche und IL-8-Messung 23
3.3.1 Infektion der AGS-ZeUen 23
3.3.2 Bestimmung der IL-8-Sekretion 24
3.4 Molekularbiologische Verfahren 24
3.4.1 Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren 24
3.4.2 Polymerase Kettenreaktion 24
3.4.3 Klonierungen und Transformation 28
3.4.4 Sequenzierung 29
3.5 Computerprogramme und Datenbanken. 34
3.6 Puffer und Reagenzien 35
4 Ergebnisse 36
4.1 Hp-mduzierte Sekretion von IL-8 aus AGS-ZeUen. 36
4.1.1 Vorversuche 36
4.1.2 Untersuchung der Stämme auf IL-8-Sekretion. 37
4.2 PCR-Screening 40
4.2.1 Übersicht 40
4.2.2 PCR-Ergebnisse 44
4.2.3 Asiatische Vergleichsstämme 46
4.3 Sequenzanalyse 48
4.3.1 Übersicht 48
4.3.2 Einzelbetrachtung der Open readingframes 54
4.3.3 Zusammenhang zwischen Sequenzierung und PCR-Screening 74
4.3.4 Gesamtsequenzen und Alignments 75
5 Diskussion 76
5.1 PCR-Screening 76
5.2 Sequenzierung der PAI unterschiedlicher Stämme 79
5.3 Interpretation der Sequenzierergebnisse 80
5.3.1 Funktionelle Bedeutung der PAI ORFs 80
5.3.2 Interpretation der gefundenen Veränderungen 83
5.3.3 Besondere Struktur von cagl 89
5.4 Induktion von IL-8 in AGS-ZeUen 96
5.5 Verbindung zwischen klinischen und experimenteUen Daten 99
6 Zusammenfassung 104
7 Danksagung 107
8 Anhang 108
9 TabeUenverzeichnis 117
10 Abbildungsverzeichnis 117
11 Lebenslauf 139
m
Tabellen- und Abbildungen
9 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 In dieser Arbeit verwendete Stämme 22
Tabelle 2 Sequenzen der PCR-Primer, Position und Orientierung 27
Tabelle 3 Übersicht der zusätzlich verwendeten Primer 30
Tabelle 4 IL-8-Sekretion der untersuchten Stämme bei MOI50 38
Tabelle 5 Übersicht über durchgeführte PCRs 45
Tabelle 6 PCR bei den asiatischen Vergleichsstämmen 47
Tabelle 7 Übersicht PAI-ORFs mit Längen, Start- und Stopp-Positionen 50
Tabelle 8 Identitäten der einzelnen ORFs 55
Tabelle 9 Grundstruktur Cag7 63
Tabelle 10 Funktionelle Daten PAI-ORFs 82
Tabelle 11 Langenvergleich ORFs verschiedener Stämme 87
Tabelle 12 Tyrosin-Phosphorylierung CagA und Hummingbird 88
Tabelle 13 AS-Motive der Repeatregion II von Cag7 mit möglicher Gruppenbildung 93
Tabelle 14 Längenvergleich Repeats Cag7 95
Tabelle 15 Nomenklatur Helicobacterpylori PAI-ORFs 108
Tabelle 16 Verwendete Stämme und histopathologische Befunde 109
Tabelle 17 Identitäten verschiedener ORFs 116
10 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Prävalenz hp-lnfektion bei verschiedenen Krankheitsbildern 9
Abbildung 2: Mögliche Entwicklung einer Infektion mit Hp 11
Abbildung 3: Grundstruktur der cag-PM 16
Abbildung 4 Einfluss cag-PAl Translokation CagA und IL-8-lnduktion 19
Abbildung 5 Vermutete Struktur des Typ-IV-Sekretionsapparates von Hp 20
Abbildung 6 PCR-Strategie bei Ausfall eines Amplikons 25
Abbildung 7 PAI-Übersicht mit Primerpositionen und Amplicons 26
Abbildung 8 Sequenzierstrategie bei größeren Ausfällen 31
Abbildung 9 Sequenzierungsstrategie von cag7 32
Abbildung 10 Ablauf nested-deletion 34
Abbildung 11 IL-8-Sekretion bei verschieden langer Versuchsdauer 36
Abbildung 12 IL-8-Sekretion bei 8 h Versuchsdauer versch. MOIs 37
Abbildung 13 IL-8-Sekretion MOI 50 für 8 Stunden 38
Abbildung 14 IL-8-Sekretion MOI 0,5 für 8 Stunden 39
Abbildung 15 Anstieg der IL-8-Sekretion zwischen MOI 0,5 und MOI 50 40
Abbildung 16 Übersicht PCRs aller Stämme 43
Abbildung 17 Medianwerte der Länge der einzelnen ORFs 50
Abbildung 18 Übersicht der intergenischen Abschnitte 51
Abbildung 19 Grafisches Gesamtalignment 53
Abbildung 20 Alignment der DNA-Sequenzen von hpO521 56
Abbildung 21 Aufbau der DNA-Sequenz von cagY 56
Abbildung 22 Vergleich der DNA-Sequenzen von hpO527 57
Abbildung 23 Darstellung der Sequenzidentität auf AS-Ebene 58
Abbildung 24 Darstellung der Repeat-Organisation der DNA-Struktur von cag7... 63
Abbildung 25 Repeat-Struktur von HpO527 auf AS-Ebene 64
117
Tabellen- und Abbildungen
Abbildung 26 Aufbau der Repeatregion 1 64
Abbildung 27 AS-Alignment HpO535 66
Abbildung 28 DNA-Alignment hpO531 68
Abbildung 29 Alignment DNA-Sequenz hpO536 69
Abbildung 30 Abweichungen im Endbereich von hpO543 71
Abbildung 31 AS-Alignment von HhpO545 72
Abbildung 32 AS-Alignment von HpO546 72
Abbildung 33 Aufbau-Varianten Region um hpO535 85
118
|
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Eidesstattliche Erklärung II
1 Abkürzungsverzeichnis IV
2 Einleitung 1
2.1 Allgemeines und Geschichte 1
2.2 Infektiologie und Epidemiologie 3
2.3 Diagnostik und Therapie 5
2.4 Pathogenese und Pathogenität 8
2.5 Zielsetzung und allgemeine Vorgehensweise 21
3 Material und Methoden 22
3.1 Helicobacter pylori 22
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3.3 Infektionsversuche und IL-8-Messung 23
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4.2 PCR-Screening 40
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4.3.3 Zusammenhang zwischen Sequenzierung und PCR-Screening 74
4.3.4 Gesamtsequenzen und Alignments 75
5 Diskussion 76
5.1 PCR-Screening 76
5.2 Sequenzierung der PAI unterschiedlicher Stämme 79
5.3 Interpretation der Sequenzierergebnisse 80
5.3.1 Funktionelle Bedeutung der PAI ORFs 80
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5.3.3 Besondere Struktur von cagl 89
5.4 Induktion von IL-8 in AGS-ZeUen 96
5.5 Verbindung zwischen klinischen und experimenteUen Daten 99
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10 Abbildungsverzeichnis 117
11 Lebenslauf 139
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Tabellen- und Abbildungen
9 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 In dieser Arbeit verwendete Stämme 22
Tabelle 2 Sequenzen der PCR-Primer, Position und Orientierung 27
Tabelle 3 Übersicht der zusätzlich verwendeten Primer 30
Tabelle 4 IL-8-Sekretion der untersuchten Stämme bei MOI50 38
Tabelle 5 Übersicht über durchgeführte PCRs 45
Tabelle 6 PCR bei den asiatischen Vergleichsstämmen 47
Tabelle 7 Übersicht PAI-ORFs mit Längen, Start- und Stopp-Positionen 50
Tabelle 8 Identitäten der einzelnen ORFs 55
Tabelle 9 Grundstruktur Cag7 63
Tabelle 10 Funktionelle Daten PAI-ORFs 82
Tabelle 11 Langenvergleich ORFs verschiedener Stämme 87
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Tabelle 15 Nomenklatur Helicobacterpylori PAI-ORFs 108
Tabelle 16 Verwendete Stämme und histopathologische Befunde 109
Tabelle 17 Identitäten verschiedener ORFs 116
10 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Prävalenz hp-lnfektion bei verschiedenen Krankheitsbildern 9
Abbildung 2: Mögliche Entwicklung einer Infektion mit Hp 11
Abbildung 3: Grundstruktur der cag-PM 16
Abbildung 4 Einfluss cag-PAl Translokation CagA und IL-8-lnduktion 19
Abbildung 5 Vermutete Struktur des Typ-IV-Sekretionsapparates von Hp 20
Abbildung 6 PCR-Strategie bei Ausfall eines Amplikons 25
Abbildung 7 PAI-Übersicht mit Primerpositionen und Amplicons 26
Abbildung 8 Sequenzierstrategie bei größeren Ausfällen 31
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Abbildung 18 Übersicht der intergenischen Abschnitte 51
Abbildung 19 Grafisches Gesamtalignment 53
Abbildung 20 Alignment der DNA-Sequenzen von hpO521 56
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Tabellen- und Abbildungen
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