Der Einfluss humanen Leptins auf die Proliferation von humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen:
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2006
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung 1
1.1 Fettgewebe und Adipositas 1
1.2 Allgemeines über Leptin und Leptinrezeptoren 2
1.2.1 Entdeckung und Struktur von Leptin 2
1.2.2 Vorkommen 4
1.2.3 Leptinrezeptoren 4
1.2.4 Funktionen 6
1.2.5 Leptin in Abhängigkeit vom Alter 11
1.3 Leptin und Proliferation 11
1.3.1 Die proliferative Wirkung von Leptin auf Zellen 11
1.3.2 Wechselwirkungen zwischen Leptin und anderen Faktoren bezogen
auf die Proliferation 12
1.4 Endothelzellen 13
1.4.1 Allgemeines über Endothelzellen 13
1.4.2 Faktoren mit proliferativer Wirkung auf Endothelzellen 15
1.5Angiogenese 17
2 Fragestellung 19
2.1 Stimulationsfähigkeit der HUVECs durch Leptin und andere
Wachstumsfaktoren 19
2.2 Produzieren HUVECs Leptin? 19
3 Material und Methoden 20
3.1 Material 20
3.1.1 Chemikalien 20
3.1.2 Allgemeine Puffer und Lösungen 20
3.1.3 Zellkulturmedien 21
3.1.4 Stimulationsfaktoren 22
3.1.5 Mykoplasmenfärbung 22
3.1.6 Lösungen für Molekularbiologie 22
IV
3.1.7 Zellen 23
3.1.8 Verwendete Software 23
3.2 Methoden 23
3.2.1 Gewinnung und Kultivierung der HUVECs 23
3.2.2 Charakterisierung der Primärzellkultur 25
3.2.3 Immunhistochemie 26
3.2.4 Molekularbiologische Methoden 28
3.2.5 Stimulation der HUVECs 33
4 Resultate 38
4.1 Kultivierung der HUVECs 38
4.2 Charakterisierung der HUVECs 39
4.2.1 Durchflusszytometrie 39
4.2.2 Immunhistochemie 40
4.3 Reverse Transkription Polymerase Ketten Reaktion (RT PCR) 41
4.3.1 RNA Elimination und RT Ansatz 41
4.3.2 GAPDH PCR 41
4.4 Nachweis verschiedener Leptinrezeptoren (ObR) an HUVECs 42
4.4.1 ObR Nachweis durch RT PCR 42
4.4.2 Immunhistochemischer Nachweis von ObR an HUVECs 42
4.5 Proliferationsassays 45
4.5.1 Ermittelte optimale Zellzahl für folgende Stimulationsversuche.... 45
4.5.2 Stimulation der HUVECs mit FCS 46
4.5.3 Stimulation der HUVECs mit unterschiedlichen Faktoren 48
4.5.4 Untersuchung auf Dosisabhängigkeit 51
4.6 Leptinproduktion bei HUVECs 53
4.6.1 PCR 53
4.6.2 Immunhistochemie 53
4.7 Zusammenfassung der Ergebnisse 55
5 Diskussion 56
5.1 Vergleich zu bereits durchgeführten Studien 57
5.1.1 Leptinrezeptornachweis 57
V
5.1.2 Proliferationsassays 57
5.2Angiogene Wirkung von Leptin auf HUVECs? 61
5.3Leptinexpression in HUVECs 62
6 Zusammenfassung der Arbeit 64
7 Literaturverzeichnis 67
8 Anhang 78
8.1 Handling der Zellkulturen unter sterilen Bedingungen 78
8.1.1 Zellen splitten 78
8.1.2 Mediumwechsel 78
8.1.3 Zellen einfrieren 78
8.1.4 Zellen zählen 79
8.2 Protokoll FACS Analyse 79
8.3RNA lsolierung mit RNeasy Mini Kit(Quiagen, Hilden, Deutschland) 80
8.4 Färbeprotokoll Immunhistochemie 81
8.5 Pipettierschemata PCR 82
8.5.1 GAPDH PCR 82
8.5.2 PCR ObR long 82
8.5.3 PCR ObR Iso 219.1 82
8.5.4 PCR ObR Iso 219.2 83
8.5.5 PCR ObR Iso 219.3 83
8.5.6 PCR Leptin 83
8.6 Erstellen einer Verdünnungsreihe 84
8.6.1 WST 1 Test nach 24 h 84
8.6.2 CASY1 Test nach 24 h 84
8.6.3 WST 1 Test nach 48 h 84
9 Abkürzungsverzeichnis 85
10Abbildungs und Tabellenverzeichnis 87
VI
11 Selbständigkeitserklärung 88
12Danksagungen 89
13Curriculum vitae 90
VII
Abbildungs und Tabellenverzeichnis
10 ABBILDUNGS UND TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1 Pufferund Lösungen 21
Tabelle 2 Zellkulturmedien 22
Tabelle 3 Eingesetzte Faktoren zur Zellstimulation 22
Tabelle 4 Mykoplasmenfärbung 22
Tabelle 5 Lösungen für Molekularbiologie 22
Tabelle 6 Antikörper Leptinrezeptoren 27
Tabelle 7 Antikörper Leptin 27
Tabelle 8 GAPDH PCR 32
Tabelle 9 PCR Bedingung lange Rezeptorform 32
Tabelle 10 PCR Bedingungen der Rezeptor Isoformen 219.1 (ObRa) und
219.3 (ObRc) 32
Tabelle 11 PCR Bedingungen Leptin 33
Tabelle 12 Verdünnungsreihe in24erWell 33
Tabelle 13 Ergebnis Übersicht der FACS Analyse 39
Tabelle 14 RNA Konzentration 41
Abbildung 1 Leptinstruktur 3
Abbildung 2 Leptinrezeptorisoformen 6
Abbildung 3 Einfluss des Fettgewebsanteils auf Leptinspiegel und Metabolismus. 8
Abbildung 4 Einflüsse auf die Leptinfreisetzung 9
Abbildung 5 HUVEC Kultur p 2 38
Abbildung 6 Quantifizierung FACS Analyse 39
Abbildung 7 Immunhistochemischer Endothelzellnachweis 40
Abbildung 8 GAPDH PCR 41
Abbildung 9 Konventionelle RT PCR auf Leptinrezeptoren 42
Abbildung 10 Immunhistochemischer Nachweis verschiedener
Leptinrezeptorformen an HUVECs 43
Abbildung 11 Immunhistochemischer Nachweis verschiedener
Leptinrezeptorformen an MCF 7 44
Abbildung 12 Verdünnungsreihe 46
Abbildung 13 Stimulation mit FCS 47
Abbildung 14 Stimulation mit FCS, Leptin, VEGF und IGF 1 50
Abbildung 15 Effekt von Leptin auf die Proliferation von HUVECs 52
Abbildung 17 Immunhistochemische Färbung auf Leptin 54
87
|
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INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung 1
1.1 Fettgewebe und Adipositas 1
1.2 Allgemeines über Leptin und Leptinrezeptoren 2
1.2.1 Entdeckung und Struktur von Leptin 2
1.2.2 Vorkommen 4
1.2.3 Leptinrezeptoren 4
1.2.4 Funktionen 6
1.2.5 Leptin in Abhängigkeit vom Alter 11
1.3 Leptin und Proliferation 11
1.3.1 Die proliferative Wirkung von Leptin auf Zellen 11
1.3.2 Wechselwirkungen zwischen Leptin und anderen Faktoren bezogen
auf die Proliferation 12
1.4 Endothelzellen 13
1.4.1 Allgemeines über Endothelzellen 13
1.4.2 Faktoren mit proliferativer Wirkung auf Endothelzellen 15
1.5Angiogenese 17
2 Fragestellung 19
2.1 Stimulationsfähigkeit der HUVECs durch Leptin und andere
Wachstumsfaktoren 19
2.2 Produzieren HUVECs Leptin? 19
3 Material und Methoden 20
3.1 Material 20
3.1.1 Chemikalien 20
3.1.2 Allgemeine Puffer und Lösungen 20
3.1.3 Zellkulturmedien 21
3.1.4 Stimulationsfaktoren 22
3.1.5 Mykoplasmenfärbung 22
3.1.6 Lösungen für Molekularbiologie 22
IV
3.1.7 Zellen 23
3.1.8 Verwendete Software 23
3.2 Methoden 23
3.2.1 Gewinnung und Kultivierung der HUVECs 23
3.2.2 Charakterisierung der Primärzellkultur 25
3.2.3 Immunhistochemie 26
3.2.4 Molekularbiologische Methoden 28
3.2.5 Stimulation der HUVECs 33
4 Resultate 38
4.1 Kultivierung der HUVECs 38
4.2 Charakterisierung der HUVECs 39
4.2.1 Durchflusszytometrie 39
4.2.2 Immunhistochemie 40
4.3 Reverse Transkription Polymerase Ketten Reaktion (RT PCR) 41
4.3.1 RNA Elimination und RT Ansatz 41
4.3.2 GAPDH PCR 41
4.4 Nachweis verschiedener Leptinrezeptoren (ObR) an HUVECs 42
4.4.1 ObR Nachweis durch RT PCR 42
4.4.2 Immunhistochemischer Nachweis von ObR an HUVECs 42
4.5 Proliferationsassays 45
4.5.1 Ermittelte optimale Zellzahl für folgende Stimulationsversuche. 45
4.5.2 Stimulation der HUVECs mit FCS 46
4.5.3 Stimulation der HUVECs mit unterschiedlichen Faktoren 48
4.5.4 Untersuchung auf Dosisabhängigkeit 51
4.6 Leptinproduktion bei HUVECs 53
4.6.1 PCR 53
4.6.2 Immunhistochemie 53
4.7 Zusammenfassung der Ergebnisse 55
5 Diskussion 56
5.1 Vergleich zu bereits durchgeführten Studien 57
5.1.1 Leptinrezeptornachweis 57
V
5.1.2 Proliferationsassays 57
5.2Angiogene Wirkung von Leptin auf HUVECs? 61
5.3Leptinexpression in HUVECs 62
6 Zusammenfassung der Arbeit 64
7 Literaturverzeichnis 67
8 Anhang 78
8.1 Handling der Zellkulturen unter sterilen Bedingungen 78
8.1.1 Zellen splitten 78
8.1.2 Mediumwechsel 78
8.1.3 Zellen einfrieren 78
8.1.4 Zellen zählen 79
8.2 Protokoll FACS Analyse 79
8.3RNA lsolierung mit RNeasy Mini Kit(Quiagen, Hilden, Deutschland) 80
8.4 Färbeprotokoll Immunhistochemie 81
8.5 Pipettierschemata PCR 82
8.5.1 GAPDH PCR 82
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8.5.4 PCR ObR Iso 219.2 83
8.5.5 PCR ObR Iso 219.3 83
8.5.6 PCR Leptin 83
8.6 Erstellen einer Verdünnungsreihe 84
8.6.1 WST 1 Test nach 24 h 84
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8.6.3 WST 1 Test nach 48 h 84
9 Abkürzungsverzeichnis 85
10Abbildungs und Tabellenverzeichnis 87
VI
11 Selbständigkeitserklärung 88
12Danksagungen 89
13Curriculum vitae 90
VII
Abbildungs und Tabellenverzeichnis
10 ABBILDUNGS UND TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1 Pufferund Lösungen 21
Tabelle 2 Zellkulturmedien 22
Tabelle 3 Eingesetzte Faktoren zur Zellstimulation 22
Tabelle 4 Mykoplasmenfärbung 22
Tabelle 5 Lösungen für Molekularbiologie 22
Tabelle 6 Antikörper Leptinrezeptoren 27
Tabelle 7 Antikörper Leptin 27
Tabelle 8 GAPDH PCR 32
Tabelle 9 PCR Bedingung lange Rezeptorform 32
Tabelle 10 PCR Bedingungen der Rezeptor Isoformen 219.1 (ObRa) und
219.3 (ObRc) 32
Tabelle 11 PCR Bedingungen Leptin 33
Tabelle 12 Verdünnungsreihe in24erWell 33
Tabelle 13 Ergebnis Übersicht der FACS Analyse 39
Tabelle 14 RNA Konzentration 41
Abbildung 1 Leptinstruktur 3
Abbildung 2 Leptinrezeptorisoformen 6
Abbildung 3 Einfluss des Fettgewebsanteils auf Leptinspiegel und Metabolismus. 8
Abbildung 4 Einflüsse auf die Leptinfreisetzung 9
Abbildung 5 HUVEC Kultur p 2 38
Abbildung 6 Quantifizierung FACS Analyse 39
Abbildung 7 Immunhistochemischer Endothelzellnachweis 40
Abbildung 8 GAPDH PCR 41
Abbildung 9 Konventionelle RT PCR auf Leptinrezeptoren 42
Abbildung 10 Immunhistochemischer Nachweis verschiedener
Leptinrezeptorformen an HUVECs 43
Abbildung 11 Immunhistochemischer Nachweis verschiedener
Leptinrezeptorformen an MCF 7 44
Abbildung 12 Verdünnungsreihe 46
Abbildung 13 Stimulation mit FCS 47
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Abbildung 17 Immunhistochemische Färbung auf Leptin 54
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