Molekulare Charakterisierung von invertiert wachsenden benignen (invertierten Papillomen) und malignen (invertierten urothelialen Karzinomen) Urotheltumoren:
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2006
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|---|---|
| adam_text | 1 EINLEITUNG
1.1 invertierte Urothelrumore 1
1.1.1 Epidemiologie 1
1.1.1.1 Invertierte Papillome 1
1.1.1.2 Invertierte urotheliale Karzinome 1
1.1.2 Klinik und Therapie 2
1.1.3 Ätiologie 3
1.1.3.1 Invertierte Papillome 3
1.1.3.2 Invertierte urotheliale Karzinome 4
1.1.4 Histopathologie S
1.1.4.1 Lokalisation 5
1.1.4.1.1 Invertiertes Papillom 5
1.1.4.1.2 Invertierte urotheliale Karzinome 6
1.1.4.2 Morphologie 6
1.1.4.2.1 Invertiertes Papillom 6
1.1.4.2.2 Invertierte urotheliale Karzinome 9
1.1.5 Diagnostische Probleme und Schwierigkeiten bei der histologischen Differenzierung 11
1.1.6 Einteilung von urothelialen Tumoren 12
1.1.6.1 Staging 12
1.1.6.2 Grading 13
1.1.6.3 Oberblick über die histopathologischen Entitäten urothelialer Tumore 14
1.1.7 Biologisches Verhalten von urothelialen Tumoren mit invertiertem Wachstumsmuster 14
1.2 Molekulare Pathogenese von urothelialen Tumoren 17
1.2.1 Krebs als molekulare Erkrankung 17
1.2.2 Übersicht über Onkogene und Tumor Suppressor Gene bei urothelialen Tumoren 17
1.2.3 Tumor Suppressor Gene 18
1.2.4 Chromosom 9 20
1.2.5 p53 20
1.2.6 Ploidie Status 21
1.2.7 FGFR3 22
1.2.8 Differenzienjngsmarker CK20 24
1.2.9 ProliferationsmarkerKi67(mib l) 25
1.2.10 Mikrosatelliteninstabilität und Mismatch Repair Proteine (MMRP) 25
1.2.11 Tumorprogrcssionsmodcll des Harnblasenkarzinoms 27
1 3 Fragestellung und Zielsetzung 31
2 MATERIAL
2.1 Chemikalien, Enzyme und Antikörper 32
2.1.1 Chemikalien 32
2.1.2 Enzyme 32
2.1.3 Antikörper 32
2.2 Puffer und Lösungen 33
2.2.1 Lösung zur Methylenblau Färbung von Genier und Paraffinschnittcn 33
2.2.2 Lösungen für die DNA Extraktion 33
2.2.3 Lösungen für die Polymerase Kettenreaktion (PCR) 33
2.2.4 Lösungen für die Polyacrylamid Gelelektrophorese 34
2.2.5 Lösungen für die Silberfärbung 34
2.2.6 Lösungen für die Immunhistologie 34
2.2.7 Lösungen für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (UroVysion®) 35
2.2.8 Lösungen für die FGFR3 Mutationsanalyse 35
23 Oligonukleotid Primer für die MikrosateUiten Analyse (MA) 35
2.4 Gewebeproben und klinisch pathologische Patientendaten 36
I
3 METHODEN
3.1 Präparation von Gewebeschnitten 38
3.1.1 Anfertigung histologischCT Schnitte 38
3.1.2 Objektträgervorbereitung 39
3.1.2.1 Paraffinmaterial auf GlasobjektträgeT 39
3.1.2.2 Gefriergewebe mit PEN Folie 39
3.1.2.3 Paraffinmatcrial mit Paraffin Tape Transfer System 40
3.2 Durchföhrong der Mikrodissektion 41
3.2.1 Mikrodissektion der Tumorareale 41
3.2.2 Abklatschpräparate 41
33 Isolierung genomiseber DNA mittels MagNA Pure LC System 42
3.3.1 Prinzip des MagNA Pure IX Systems 42
3.3.2 Vorgehen 43
3.4 Mikrosatelliten /LOH Analyse 43
3.4.1 In vitro Amplifikation genomischer DNA durch die Polymcrascketten Realction 43
3.4.1.1 Prinzip der Polymerase Keflenreaktion 43
3.4.1.2 Anwendung der PCR für die MikrosatellitenTLOH Analyse 45
3.4.1.3 Sicherheitsmaßnahmen und Fehlerquellen 46
3.4.2 Auftrennung von PCR Amplifikaten durch Polyacrylamidgel Elektrophorese (PAGE) 47
3.4.3 Silberßrbung von Polyacrylamidgelen 48
3.4.4 Interpretation der Bandenmuster 48
3.5 Mutationsanalyse des FGFR3 Gens 50
3.6 Immunhistochemische Färbungen 51
3.7 Fluoreszenz in siru Hybridisierung (FISH) 52
3.7.1 Der UroVysion® Test 52
3.7.2 Durchführung 54
3.7.3 Auszählung der Signale und Auswertung 55
3.8 Tissue Mikro Array (TMA) 57
3.9 Statistische Datenauswertung 58
4 ERGEBNISSE
4.1 Übereinstimmung Histologie 59
4.1.1 Histologische Daten 59
4.1.2 Korrelation histologischer und klinischer Daten für die Consensusdiagnose 62
4.2 LOH/MSI 63
4.2.1 MSI in modifiziertem Bethesda Panel 64
4.2.2 LOH auf Chromosom 9 65
4.2.3 LOH auf Chromosom 17 66
4.2.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der LOH Analyse 66
4.2.5 EMAST Marker 67
4.2.5.1 EMAST Status auf Chromosom 9 67
4.2.5.2 EMAST Status herkömmlicher EMAST Marker 67
4.2.5.3 EMAST Status aller EMAST Marker 67
4 J FGFR3 68
4.4 Aneuploidie/FISH 68
II
4.5 Mismatch Repair Protein Expression 69
4.6 p53 Expression 70
4.7 Differenzierungsmaker CK20 70
4.8 Proliferationsmarker mib 1 70
4.9 Korrelation der histopathologischen Ergebnisse mit klinischen und
molekularen Daten 70
4.9.1 Statistische Analyse fiir die Histologie der Consensusdiagnose 71
4.9.2 Statistische Analyse gemäß der Diagnosen in Anlehnung an die WHO Klassifikation für
erophytische urotheliale Tumoren (2004) 72
4.9.3 Beziehung zwischen FGFR3 Status und Ki67 Proliferationsindex 73
5 DISKUSSION
5.1 Reproduzierbarkeit der Histopathologie und dabei aufgetretene Probleme 82
5.2 Diskussion von relevanten Ergebnissen der molekularen Analyse 84
5.2.1 Immunhistochemie mib I und p53 84
5.2.2 Immunhistochcmie p53 vs. LOH 17pl3 85
5.2.3 Immunistochemie CK20 86
5.2.4 FISH 87
53 Invertiertes PapUlom als benigner Tumor 88
5.4 Vergleich des biologischen Verhaltens endo und exophytisch wachsender
Tumoren 91
5.4.1 Rezidivhäufigkeit und Progression 92
5.4.2 FGFR3 Status 92
5.4.3 Immunhistochemie 92
5.4.3.1 p53 92
5.4.3.2 mib 1 93
5.4.3.3 MLH1,MSH2,MSH6 93
5.4.4 Kombination aus FGFR3 und p53 Status bzw. FGFR3 und mib 1 Status 93
5.4.5 Zusammenfassung 94
5.5 Molekular biologische Marker als Hilfsmittel bei der histologischen
Differentialdiagnose zwischen IP und invCa 95
5.6 Mutatorphänotyp bei invertierten urothelialen Tumoren? 97
6 ZUSAMMENFASSUNG 99
7 ANHANG
7.1 Literaturverzeichnis 101
7.2 Abkürzungsverzeichnis 114
7 3 Lebenslauf 116
7.4 Bibliographie 116
7.5 Danksagung 117
III
|
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1 EINLEITUNG
1.1 invertierte Urothelrumore 1
1.1.1 Epidemiologie 1
1.1.1.1 Invertierte Papillome 1
1.1.1.2 Invertierte urotheliale Karzinome 1
1.1.2 Klinik und Therapie 2
1.1.3 Ätiologie 3
1.1.3.1 Invertierte Papillome 3
1.1.3.2 Invertierte urotheliale Karzinome 4
1.1.4 Histopathologie S
1.1.4.1 Lokalisation 5
1.1.4.1.1 Invertiertes Papillom 5
1.1.4.1.2 Invertierte urotheliale Karzinome 6
1.1.4.2 Morphologie 6
1.1.4.2.1 Invertiertes Papillom 6
1.1.4.2.2 Invertierte urotheliale Karzinome 9
1.1.5 Diagnostische Probleme und Schwierigkeiten bei der histologischen Differenzierung 11
1.1.6 Einteilung von urothelialen Tumoren 12
1.1.6.1 Staging 12
1.1.6.2 Grading 13
1.1.6.3 Oberblick über die histopathologischen Entitäten urothelialer Tumore 14
1.1.7 Biologisches Verhalten von urothelialen Tumoren mit invertiertem Wachstumsmuster 14
1.2 Molekulare Pathogenese von urothelialen Tumoren 17
1.2.1 Krebs als molekulare Erkrankung 17
1.2.2 Übersicht über Onkogene und Tumor Suppressor Gene bei urothelialen Tumoren 17
1.2.3 Tumor Suppressor Gene 18
1.2.4 Chromosom 9 20
1.2.5 p53 20
1.2.6 Ploidie Status 21
1.2.7 FGFR3 22
1.2.8 Differenzienjngsmarker CK20 24
1.2.9 ProliferationsmarkerKi67(mib l) 25
1.2.10 Mikrosatelliteninstabilität und Mismatch Repair Proteine (MMRP) 25
1.2.11 Tumorprogrcssionsmodcll des Harnblasenkarzinoms 27
1 3 Fragestellung und Zielsetzung 31
2 MATERIAL
2.1 Chemikalien, Enzyme und Antikörper 32
2.1.1 Chemikalien 32
2.1.2 Enzyme 32
2.1.3 Antikörper 32
2.2 Puffer und Lösungen 33
2.2.1 Lösung zur Methylenblau Färbung von Genier und Paraffinschnittcn 33
2.2.2 Lösungen für die DNA Extraktion 33
2.2.3 Lösungen für die Polymerase Kettenreaktion (PCR) 33
2.2.4 Lösungen für die Polyacrylamid Gelelektrophorese 34
2.2.5 Lösungen für die Silberfärbung 34
2.2.6 Lösungen für die Immunhistologie 34
2.2.7 Lösungen für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (UroVysion®) 35
2.2.8 Lösungen für die FGFR3 Mutationsanalyse 35
23 Oligonukleotid Primer für die MikrosateUiten Analyse (MA) 35
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I
3 METHODEN
3.1 Präparation von Gewebeschnitten 38
3.1.1 Anfertigung histologischCT Schnitte 38
3.1.2 Objektträgervorbereitung 39
3.1.2.1 Paraffinmaterial auf GlasobjektträgeT 39
3.1.2.2 Gefriergewebe mit PEN Folie 39
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3.2 Durchföhrong der Mikrodissektion 41
3.2.1 Mikrodissektion der Tumorareale 41
3.2.2 Abklatschpräparate 41
33 Isolierung genomiseber DNA mittels MagNA Pure LC System 42
3.3.1 Prinzip des MagNA Pure IX Systems 42
3.3.2 Vorgehen 43
3.4 Mikrosatelliten /LOH Analyse 43
3.4.1 In vitro Amplifikation genomischer DNA durch die Polymcrascketten Realction 43
3.4.1.1 Prinzip der Polymerase Keflenreaktion 43
3.4.1.2 Anwendung der PCR für die MikrosatellitenTLOH Analyse 45
3.4.1.3 Sicherheitsmaßnahmen und Fehlerquellen 46
3.4.2 Auftrennung von PCR Amplifikaten durch Polyacrylamidgel Elektrophorese (PAGE) 47
3.4.3 Silberßrbung von Polyacrylamidgelen 48
3.4.4 Interpretation der Bandenmuster 48
3.5 Mutationsanalyse des FGFR3 Gens 50
3.6 Immunhistochemische Färbungen 51
3.7 Fluoreszenz in siru Hybridisierung (FISH) 52
3.7.1 Der UroVysion® Test 52
3.7.2 Durchführung 54
3.7.3 Auszählung der Signale und Auswertung 55
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3.9 Statistische Datenauswertung 58
4 ERGEBNISSE
4.1 Übereinstimmung Histologie 59
4.1.1 Histologische Daten 59
4.1.2 Korrelation histologischer und klinischer Daten für die Consensusdiagnose 62
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4.2.1 MSI in modifiziertem Bethesda Panel 64
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4.2.5 EMAST Marker 67
4.2.5.1 EMAST Status auf Chromosom 9 67
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4.4 Aneuploidie/FISH 68
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4.5 Mismatch Repair Protein Expression 69
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4.7 Differenzierungsmaker CK20 70
4.8 Proliferationsmarker mib 1 70
4.9 Korrelation der histopathologischen Ergebnisse mit klinischen und
molekularen Daten 70
4.9.1 Statistische Analyse fiir die Histologie der Consensusdiagnose 71
4.9.2 Statistische Analyse gemäß der Diagnosen in Anlehnung an die WHO Klassifikation für
erophytische urotheliale Tumoren (2004) 72
4.9.3 Beziehung zwischen FGFR3 Status und Ki67 Proliferationsindex 73
5 DISKUSSION
5.1 Reproduzierbarkeit der Histopathologie und dabei aufgetretene Probleme 82
5.2 Diskussion von relevanten Ergebnissen der molekularen Analyse 84
5.2.1 Immunhistochemie mib I und p53 84
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5.4 Vergleich des biologischen Verhaltens endo und exophytisch wachsender
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5.4.1 Rezidivhäufigkeit und Progression 92
5.4.2 FGFR3 Status 92
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5.6 Mutatorphänotyp bei invertierten urothelialen Tumoren? 97
6 ZUSAMMENFASSUNG 99
7 ANHANG
7.1 Literaturverzeichnis 101
7.2 Abkürzungsverzeichnis 114
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7.4 Bibliographie 116
7.5 Danksagung 117
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| spelling | Eiber, Matthias 1979- Verfasser (DE-588)132759802 aut Molekulare Charakterisierung von invertiert wachsenden benignen (invertierten Papillomen) und malignen (invertierten urothelialen Karzinomen) Urotheltumoren vorgelegt von Matthias Eiber 2006 III, 117 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Regensburg, Univ., Diss., 2007 Urothelkrebs (DE-588)4187259-9 gnd rswk-swf Molekularbiologie (DE-588)4039983-7 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Urothelkrebs (DE-588)4187259-9 s Molekularbiologie (DE-588)4039983-7 s b DE-604 HBZ Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=015503038&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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