Identifizierung des molekularen Targets bei der Apoptose-Induktion durch Alkylphosphocholine:
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Veröffentlicht: |
Karlsruhe
Forschungszentrum Karlsruhe
2006
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adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Krebs 1
1.2 Therapieansätze 1
1.3 Alkylphosphocholine und Krebs ein neuer Therapieansatz 2
1.4 Zielsetzung der Arbeit 4
2 Theoretische Grundlagen 5
2.1 Alkylphosphocholine 5
2.2 Apoptose die regulierte Zerstörung der Zelle 14
2.3 Todesrezeptoren die Initiatoren des Zelltods 17
2.4 Caspasen die zentrale ausführende Gewalt 19
2.5 Das Mitochondrium eine zentrale Schaltstelle der Apoptose 22
2.6 Beteiligung weiterer Zellorganellen am apoptotischen Zelltod 27
3 Material und Methoden 30
3.1 Chemikalien 30
3.2 Laborgeräte und Programmsoftware 31
3.3 Zellkultur 32
3.3.1 Die Jurkat T Zelllinien 33
3.3.2 Die B Zelllinie BJAB 34
3.3.3 Die SKW 6.4 Zellen 35
3.3.4 K562 Zellen 36
3.3.5 HL 60 Zellen 37
3.3.6 HeLa Zellen 37
3.3.7 Bestimmung der Zellzahl 38
3.3.8 Langzeitkonservierung und in Kultumahme von Zellen 38
3.4 Isolierung von Blutlymphozyten aus Vollblut 39
3.5 Vitalitäts Tests 40
3.5.1 Trypanblau Färbung 40
_
3.5.2 MTT Assay 40
3.6 Proteinanalytik 42
3.6.1 Proteinbestimmung 42
3.6.2 Herstellung von Ganzzellextrakten 42
3.6.3 SDS Polyacrylamid Gel Elektrophorese(SDS PAGE) 43
3.6.4 DasBlotten 44
3.6.5 Immunologischer Nachweis von Proteinen 45
3.7 Isolierung apoptotischer DNA Fragmente 47
3.8 Durchflusszytometrie 49
3.8.1 Unterscheidung und Quantifizierung von Apoptose und Nekrose mittels Annexin V
FITC/Propidiumiodid Färbung 49
3.8.2 Messung des mitochondrialen Membranpotenzials (A*Fm) 50
3.8.3 Bestimmung der lysosomalen Membranintegrität 50
3.9 Immunfluoreszenzmikroskopie 52
3.9.1 Fluoreszenzfärbung fixierter Zellen 52
3.9.2 Kernfärbung mit Bisbenzimid (Hoechst 33342) 53
3.10 Caspase Assay 53
3.11 Co Immunopräzipitation 54
3.12 Isolierung von Lipid Rafts 55
3.13 Zytosolisolierung 56
3.14 Aufnahme und Metabolismus radioaktiv markierter Lipide 57
3.14.1 Aufnahmekinetik der radioaktiven Lipide 57
3.14.2 Extraktion zellulärer Lipide 58
3.14.3 Dünnschichtchromatographie und Visualisierung der Lipidbanden 58
3.14.4 Autoradiographie 59
3.15 Plasmidklonierung und Transfektion von pKEX 2 XR APO 1 59
3.15.1 Herstellung und Transformation kompetenter Bakterien 59
3.15.2 Amplifizierung und Isolation von Plasmiden 60
3.15.3 Transfektion eukaryotischer Suspensionszellen 61
3.16 Bestimmung reaktiver Sauerstoff und Stickstoffspezies 61
3.17 Elektronenmikroskopie 62
_
4 Ergebnisse 64
4.1 Morphologische Veränderungen durch Einwirkung von APC 64
4.1.1 APC beeinträchtigen das Zellwachstum 64
4.1.2 Beobachtung der morphologischen Veränderungen 65
4.2 Aufnahme und Metabolismus von APC 67
4.2.1 Aufnahmekinetik 68
4.2.2 Stoffwechsel und Metabolismus von [14C] R NC 2 69
4.2.3 Mögliche Hemmung der Aufnahme durch Suramin? 72
4.3 S NC 2 induziert Apoptose in leukämischen Zellen 74
4.3.1 S NC 2 induziert eine Externalisierung von Phosphatidylserin 74
4.3.2 Aktivierung der Caspasen Kaskade 79
4.3.3 Behandlung mit S NC 2 führt zu nuklearen Veränderungen 85
4.3.4 Suramin besitzt keine Apoptose inhibierende Eigenschaft 88
4.4 Aktivierung der Todesrezeptoren 89
4.4.1 Immunhistochemische Untersuchungen zum Rezeptorclustering 89
4.4.2 FADDdn Zellen erweisen sich als wenig sensitiv gegenüber S NC 2 induzierter
Apoptose 93
4.4.3 Co Immunpräzipitation 94
4.4.4 Die S NC 2 induzierte Aktivierung des CD95 Rezeptors resultiert nicht aus
autokrinen oder parakrinen Effekten 95
4.5 Die resistente Zelllinie K562 96
4.6 Die mitochondriale Beteiligung 100
4.6.1 Hemmung der Apoptose durch Bcl 2 101
4.6.2 Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials 107
4.6.3 Induziert S NC 2 eine Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies? 113
4.6.4 Bid eine Möglichkeit der mitochondrialen Permeabilisierung? 114
4.6.5 Die Freisetzung pro apoptotischer Proteine 117
4.7 Beteiligung zellulärer Organellen am programmierten Zelltod 120
4.7.1 Lysosomen 120
4.7.2 Mögliche Beteiligung des endoplasmatischen Retikulums? 126
4.8 Resistenz primärer Lymphozyten 127
4.9 APC und LPC 130
_
5 Diskussion 133
5.1 Aufnahme und zelluläre Veränderung 134
5.2 S NC 2 und Apoptose 137
5.2.1 Einfluss auf das Wachstumsverhalten 137
5.2.2 Morphologische Veränderungen 138
5.2.3 Beteiligung der Todesrezeptoren 139
5.2.4 Aktivierung der Caspase Kaskade: Typ I und Typ II Zellen im Vergleich 142
5.3 Intrazellulärer Crosstalk 145
5.3.1 Der Verlust des MMP geht ohne die Freisetzung von ROS einher 145
5.3.2 Die Rolle von Bid während des apoptotischen Signalwegs 146
5.3.3 Die Freisetzung von Cytochrom c und Smac/DIABLO 149
5.3.4 Lysosomen als Verstärker der Apoptose? 151
5.3.5 Das endoplasmatische Retikulum ein weiterer Mitspieler? 152
5.4 Resistenz primärer Blutzellen und Reduktion der Zytotoxizität durch LPC 152
5.5 Zeitlicher Ablauf der S NC 2 induzierten Apoptose 154
5.6 Möglicher Verlauf der S NC 2 induzierten Apoptose: eine Arbeitshypothese 155
6 Literatur 158
7 Abkürzungsverzeichnis 170
8 Abbildungs und Tabellenverzeichnis 173
VI
|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Krebs 1
1.2 Therapieansätze 1
1.3 Alkylphosphocholine und Krebs ein neuer Therapieansatz 2
1.4 Zielsetzung der Arbeit 4
2 Theoretische Grundlagen 5
2.1 Alkylphosphocholine 5
2.2 Apoptose die regulierte Zerstörung der Zelle 14
2.3 Todesrezeptoren die Initiatoren des Zelltods 17
2.4 Caspasen die zentrale ausführende Gewalt 19
2.5 Das Mitochondrium eine zentrale Schaltstelle der Apoptose 22
2.6 Beteiligung weiterer Zellorganellen am apoptotischen Zelltod 27
3 Material und Methoden 30
3.1 Chemikalien 30
3.2 Laborgeräte und Programmsoftware 31
3.3 Zellkultur 32
3.3.1 Die Jurkat T Zelllinien 33
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3.3.7 Bestimmung der Zellzahl 38
3.3.8 Langzeitkonservierung und in Kultumahme von Zellen 38
3.4 Isolierung von Blutlymphozyten aus Vollblut 39
3.5 Vitalitäts Tests 40
3.5.1 Trypanblau Färbung 40
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3.5.2 MTT Assay 40
3.6 Proteinanalytik 42
3.6.1 Proteinbestimmung 42
3.6.2 Herstellung von Ganzzellextrakten 42
3.6.3 SDS Polyacrylamid Gel Elektrophorese(SDS PAGE) 43
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3.6.5 Immunologischer Nachweis von Proteinen 45
3.7 Isolierung apoptotischer DNA Fragmente 47
3.8 Durchflusszytometrie 49
3.8.1 Unterscheidung und Quantifizierung von Apoptose und Nekrose mittels Annexin V
FITC/Propidiumiodid Färbung 49
3.8.2 Messung des mitochondrialen Membranpotenzials (A*Fm) 50
3.8.3 Bestimmung der lysosomalen Membranintegrität 50
3.9 Immunfluoreszenzmikroskopie 52
3.9.1 Fluoreszenzfärbung fixierter Zellen 52
3.9.2 Kernfärbung mit Bisbenzimid (Hoechst 33342) 53
3.10 Caspase Assay 53
3.11 Co Immunopräzipitation 54
3.12 Isolierung von Lipid Rafts 55
3.13 Zytosolisolierung 56
3.14 Aufnahme und Metabolismus radioaktiv markierter Lipide 57
3.14.1 Aufnahmekinetik der radioaktiven Lipide 57
3.14.2 Extraktion zellulärer Lipide 58
3.14.3 Dünnschichtchromatographie und Visualisierung der Lipidbanden 58
3.14.4 Autoradiographie 59
3.15 Plasmidklonierung und Transfektion von pKEX 2 XR APO 1 59
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3.16 Bestimmung reaktiver Sauerstoff und Stickstoffspezies 61
3.17 Elektronenmikroskopie 62
_
4 Ergebnisse 64
4.1 Morphologische Veränderungen durch Einwirkung von APC 64
4.1.1 APC beeinträchtigen das Zellwachstum 64
4.1.2 Beobachtung der morphologischen Veränderungen 65
4.2 Aufnahme und Metabolismus von APC 67
4.2.1 Aufnahmekinetik 68
4.2.2 Stoffwechsel und Metabolismus von [14C] R NC 2 69
4.2.3 Mögliche Hemmung der Aufnahme durch Suramin? 72
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4.3.1 S NC 2 induziert eine Externalisierung von Phosphatidylserin 74
4.3.2 Aktivierung der Caspasen Kaskade 79
4.3.3 Behandlung mit S NC 2 führt zu nuklearen Veränderungen 85
4.3.4 Suramin besitzt keine Apoptose inhibierende Eigenschaft 88
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4.4.4 Die S NC 2 induzierte Aktivierung des CD95 Rezeptors resultiert nicht aus
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4.6 Die mitochondriale Beteiligung 100
4.6.1 Hemmung der Apoptose durch Bcl 2 101
4.6.2 Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials 107
4.6.3 Induziert S NC 2 eine Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies? 113
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4.6.5 Die Freisetzung pro apoptotischer Proteine 117
4.7 Beteiligung zellulärer Organellen am programmierten Zelltod 120
4.7.1 Lysosomen 120
4.7.2 Mögliche Beteiligung des endoplasmatischen Retikulums? 126
4.8 Resistenz primärer Lymphozyten 127
4.9 APC und LPC 130
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5 Diskussion 133
5.1 Aufnahme und zelluläre Veränderung 134
5.2 S NC 2 und Apoptose 137
5.2.1 Einfluss auf das Wachstumsverhalten 137
5.2.2 Morphologische Veränderungen 138
5.2.3 Beteiligung der Todesrezeptoren 139
5.2.4 Aktivierung der Caspase Kaskade: Typ I und Typ II Zellen im Vergleich 142
5.3 Intrazellulärer Crosstalk 145
5.3.1 Der Verlust des MMP geht ohne die Freisetzung von ROS einher 145
5.3.2 Die Rolle von Bid während des apoptotischen Signalwegs 146
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5.4 Resistenz primärer Blutzellen und Reduktion der Zytotoxizität durch LPC 152
5.5 Zeitlicher Ablauf der S NC 2 induzierten Apoptose 154
5.6 Möglicher Verlauf der S NC 2 induzierten Apoptose: eine Arbeitshypothese 155
6 Literatur 158
7 Abkürzungsverzeichnis 170
8 Abbildungs und Tabellenverzeichnis 173
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