Expression von BK-Kanälen in humanen Gliomen unterschiedlicher Malignität:
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Titel: Expression von BK-Kanälen in humanen Gliomen unterschiedlicher Malignität
Autor: Brodoehl, Stefan
Jahr: 2005
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung 11
2 Einleitung 13
2.1 Hirntumoren 13
2.1.1 Primäre und sekundäre Hirntumoren 13
2.1.2 Klassifikation und Pathologie von humanen Gliomen 15
2.2 Ionenkanäle 20
2.2.1 Kaliumkanäle 20
2.2.2 Struktur und Charakteristika von BK-Kanälen 23
2.3 Microarray-Experimente 26
3 Ziele der Arbeit 28
4 Materialien und Methoden 29
4.1 Auswahl und Verarbeitung der Gewebeproben 29
4.1.1 Herkunft der Gewebeproben 29
4.1.2 Probenverarbeitung und histologische Beurteilung 29
4.2 Semi-quantitative RT-PCR 33
4.2.1 Prinzip 33
4.2.2 RNA-Gewinnung (Extraktion) 34
4.2.3 cDNA-Synthese (Reverse Transkription) 35
4.2.4 Äquilibrierung auf /3-Actin-Standard 36
4.2.5 Primerdesign 37
4.2.6 Isoform-spezifische PCR 39
4.2.7 Auswertung 41
4.3 Microarray-Experimente 43
4.3.1 Der Human Genome U95 Av2 Array 43
5
4.3.2 Analyse und Darstellung von Microarray-Daten 43
4.3.3 Verfahren zur Normalisierung von Microarray-Daten 44
4.3.4 Clusterverfahren 47
4.3.5 Computergestützte Auswertung der Microarray-Daten 52
4.4 Verwendete Materialien, Methoden und Geräte 53
4.4.1 Materialien 53
4.4.2 Geräte 54
4.4.3 Software und Internet 55
5 Ergebnisse 56
5.1 RT-PCR 56
5.1.1 a-Untereinheit 58
5.1.2 /^-Untereinheit 59
5.1.3 /^-Untereinheit 60
5.1.4 /^-Untereinheit 61
5.1.5 ^-Untereinheit 62
5.2 Analyse des BK-Kanals mit dem Microarray 64
5.2.1 Hierarchical Clustering 66
5.2.2 K-Means Clustering 67
5.2.3 SOM - Seif Organizing Map 69
5.2.4 ANOVA 72
5.2.5 PCA 73
5.3 Zusammenfassender Vergleich RT-PCR - Microarray 74
6 Diskussion 76
6.1 Expression von BK-Kanälen in normalem Hirngewebe 77
6.2 Expression von BK-Kanälen in Gliomen 78
6.3 Bedeutung von Ionenkanälen in Gliomen 81
6.3.1 Modifizierte Ca2+-Sensitivität 82
6.3.2 Zellzyklus und Proliferation 83
6.3.3 Migration und Invasion 86
6.3.4 Zusammenfassung 89
6.4 Molekulare und funktioneile Gliomdifferenzierung 89
6.4.1 Klassifizierung von Gliomen - Auswahl molekularer Marker . 90
6.4.2 Ionenkanäle als molekulare Marker 91
6
7 Zusammenfassende Schlussfolgerungen 95
8 Literaturverzeichnis 96
9 Anhang 108
9.1 Danksagung 108
9.2 Lebenslauf 109
9.3 Ehrenwörtliche Erklärung HO
7
Abbildungsverzeichnis
2.1 Klinisch und genetisch definierte Progressionswege zum Glioblastom (Kleihues
und Ohgaki 1999) 18
2.2 Membrantopologie der zwei verschiedenen Gruppen der Kaliumkanäle 21
2.3 Transmembransegmente spannungsgesteuerter Kaliumkanäle 23
2.4 Bauweisen spannungsgesteuerter 6TM-Kaliumkanäle 24
2.5 Struktur der a-Untereinheit des BK-Kanals 25
2.6 Die ß-Untereinheit und ihre Lokalisation in verschiedenen Geweben 25
2.7 Affymetrix GeneChip - Design der Probenpaare (probe pairs) 27
2.8 Untersuchung der Genexpression mit Affymetrix GeneChip 27
4.1 Kryoschnitt und HE-Färbung 30
4.2 Histologie des Probenmaterials 31
4.3 Schema der RT-PCR 33
4.4 Phasen der DNA-Amplifikation bei einer PCR 34
4.5 RNA-Isolation und Qualitätskontrolle 36
4.6 PCR mit ß-Actin-Primern bei 24/28/32/36/40 Zyklen 37
4.7 ß-Actin-Äquilibrierung mit 30 PCR-Zyklen 37
4.8 Splicevarianten der a-Untereinheit 38
4.9 Gelelektrophorese mit Primer-Dimeren 39
4.10 Gelelektrophorese der PCR aller BK-Primer bei verschiedenen Zyklen 40
4.11 Densitometrische Auswertung einer Gelelektrophorese 41
4.12 Normalisierung - Logarithmische Transformation 45
4.13 Normalisierung - Mittelwert- und Medianzentrierung 46
4.14 Normalisierung - Division durch Standardabweichung (SD) 47
4.15 Übersicht über Clusterverfahren 48
4.16 Hierarchisches Clustern mit einem agglomerativen Verfahren 50
8
4.17 Verschiedene agglomerative Verfahren zum hierarchischen Clustern 50
4.18 K-Means Clustern mit 2 Clustern 51
4.19 Seif Organizing Map 51
5.1 Ergebnisse der PCR 57
5.2 Auswertung der Ergebnisse der a-Untereinheit 58
5.3 Auswertung der Ergebnisse der p2-Untereinheit 60
5.4 Auswertung der Ergebnisse der ß^-Untereinheit 62
5.5 Expression-Image von 201 Ionenkanälen auf Microarray 64
5.6 Splicevarianten der a-Untereinheit auf Microarray HG-U95Av2 65
5.7 Isoformen der ßi-Untereinheit auf Microarray HG-U95Av2 65
5.8 Hierarchical Clustering (Gene und Experimente) 67
5.9 K-Means Clustering für 3 Experimente 68
5.10 K-Means Clustering für 4 Gengruppen 68
5.11 SOM mit 16 (4 x 4) Clustern 70
5.12 Auswahl von Clustern des SOM(4 x 4.) 71
5.13 ANOVA der normalisierten Werte 73
5.14 Hauptkomponentenanalyse mit zweidimensionaler Darstellung 74
6.1 Diskriminierung mit Gensignatur aus Ionenkanälen 91
9
Tabellenverzeichnis
2.1 WHO-Klassifikation der Hirntumoren (Kleihues et al. 2002) 14
2.2 Gliome und ihre WHO-Klassifikation (Kleihues et al. 2002) 16
2.3 KCN-Klassifikation der Kaliumkanäle (Gutman et al. 2003) 22
4.1 Ausgewählte Gewebeproben mit histologischem Befund 32
4.2 PCR-Bedingungen für ß-Actin 36
4.3 Beispiel einer Expressionsmatrix 44
4.4 Chemikalien und Kits 53
4.5 Reaktionsmix für cDNA-Synthese und PCR 53
4.6 Primer 54
4.7 Geräte 54
4.8 Software und Internet 55
5.1 Signalwerte der Sequenzen für BK-Kanäle auf dem Microarray 66
5.2 Zusammenfassender Überblick der Untersuchungsergebnisse 75
10 |
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Titel: Expression von BK-Kanälen in humanen Gliomen unterschiedlicher Malignität
Autor: Brodoehl, Stefan
Jahr: 2005
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung 11
2 Einleitung 13
2.1 Hirntumoren 13
2.1.1 Primäre und sekundäre Hirntumoren 13
2.1.2 Klassifikation und Pathologie von humanen Gliomen 15
2.2 Ionenkanäle 20
2.2.1 Kaliumkanäle 20
2.2.2 Struktur und Charakteristika von BK-Kanälen 23
2.3 Microarray-Experimente 26
3 Ziele der Arbeit 28
4 Materialien und Methoden 29
4.1 Auswahl und Verarbeitung der Gewebeproben 29
4.1.1 Herkunft der Gewebeproben 29
4.1.2 Probenverarbeitung und histologische Beurteilung 29
4.2 Semi-quantitative RT-PCR 33
4.2.1 Prinzip 33
4.2.2 RNA-Gewinnung (Extraktion) 34
4.2.3 cDNA-Synthese (Reverse Transkription) 35
4.2.4 Äquilibrierung auf /3-Actin-Standard 36
4.2.5 Primerdesign 37
4.2.6 Isoform-spezifische PCR 39
4.2.7 Auswertung 41
4.3 Microarray-Experimente 43
4.3.1 Der Human Genome U95 Av2 Array 43
5
4.3.2 Analyse und Darstellung von Microarray-Daten 43
4.3.3 Verfahren zur Normalisierung von Microarray-Daten 44
4.3.4 Clusterverfahren 47
4.3.5 Computergestützte Auswertung der Microarray-Daten 52
4.4 Verwendete Materialien, Methoden und Geräte 53
4.4.1 Materialien 53
4.4.2 Geräte 54
4.4.3 Software und Internet 55
5 Ergebnisse 56
5.1 RT-PCR 56
5.1.1 a-Untereinheit 58
5.1.2 /^-Untereinheit 59
5.1.3 /^-Untereinheit 60
5.1.4 /^-Untereinheit 61
5.1.5 ^-Untereinheit 62
5.2 Analyse des BK-Kanals mit dem Microarray 64
5.2.1 Hierarchical Clustering 66
5.2.2 K-Means Clustering 67
5.2.3 SOM - Seif Organizing Map 69
5.2.4 ANOVA 72
5.2.5 PCA 73
5.3 Zusammenfassender Vergleich RT-PCR - Microarray 74
6 Diskussion 76
6.1 Expression von BK-Kanälen in normalem Hirngewebe 77
6.2 Expression von BK-Kanälen in Gliomen 78
6.3 Bedeutung von Ionenkanälen in Gliomen 81
6.3.1 Modifizierte Ca2+-Sensitivität 82
6.3.2 Zellzyklus und Proliferation 83
6.3.3 Migration und Invasion 86
6.3.4 Zusammenfassung 89
6.4 Molekulare und funktioneile Gliomdifferenzierung 89
6.4.1 Klassifizierung von Gliomen - Auswahl molekularer Marker . 90
6.4.2 Ionenkanäle als molekulare Marker 91
6
7 Zusammenfassende Schlussfolgerungen 95
8 Literaturverzeichnis 96
9 Anhang 108
9.1 Danksagung 108
9.2 Lebenslauf 109
9.3 Ehrenwörtliche Erklärung HO
7
Abbildungsverzeichnis
2.1 Klinisch und genetisch definierte Progressionswege zum Glioblastom (Kleihues
und Ohgaki 1999) 18
2.2 Membrantopologie der zwei verschiedenen Gruppen der Kaliumkanäle 21
2.3 Transmembransegmente spannungsgesteuerter Kaliumkanäle 23
2.4 Bauweisen spannungsgesteuerter 6TM-Kaliumkanäle 24
2.5 Struktur der a-Untereinheit des BK-Kanals 25
2.6 Die ß-Untereinheit und ihre Lokalisation in verschiedenen Geweben 25
2.7 Affymetrix GeneChip - Design der Probenpaare (probe pairs) 27
2.8 Untersuchung der Genexpression mit Affymetrix GeneChip 27
4.1 Kryoschnitt und HE-Färbung 30
4.2 Histologie des Probenmaterials 31
4.3 Schema der RT-PCR 33
4.4 Phasen der DNA-Amplifikation bei einer PCR 34
4.5 RNA-Isolation und Qualitätskontrolle 36
4.6 PCR mit ß-Actin-Primern bei 24/28/32/36/40 Zyklen 37
4.7 ß-Actin-Äquilibrierung mit 30 PCR-Zyklen 37
4.8 Splicevarianten der a-Untereinheit 38
4.9 Gelelektrophorese mit Primer-Dimeren 39
4.10 Gelelektrophorese der PCR aller BK-Primer bei verschiedenen Zyklen 40
4.11 Densitometrische Auswertung einer Gelelektrophorese 41
4.12 Normalisierung - Logarithmische Transformation 45
4.13 Normalisierung - Mittelwert- und Medianzentrierung 46
4.14 Normalisierung - Division durch Standardabweichung (SD) 47
4.15 Übersicht über Clusterverfahren 48
4.16 Hierarchisches Clustern mit einem agglomerativen Verfahren 50
8
4.17 Verschiedene agglomerative Verfahren zum hierarchischen Clustern 50
4.18 K-Means Clustern mit 2 Clustern 51
4.19 Seif Organizing Map 51
5.1 Ergebnisse der PCR 57
5.2 Auswertung der Ergebnisse der a-Untereinheit 58
5.3 Auswertung der Ergebnisse der p2-Untereinheit 60
5.4 Auswertung der Ergebnisse der ß^-Untereinheit 62
5.5 Expression-Image von 201 Ionenkanälen auf Microarray 64
5.6 Splicevarianten der a-Untereinheit auf Microarray HG-U95Av2 65
5.7 Isoformen der ßi-Untereinheit auf Microarray HG-U95Av2 65
5.8 Hierarchical Clustering (Gene und Experimente) 67
5.9 K-Means Clustering für 3 Experimente 68
5.10 K-Means Clustering für 4 Gengruppen 68
5.11 SOM mit 16 (4 x 4) Clustern 70
5.12 Auswahl von Clustern des SOM(4 x 4.) 71
5.13 ANOVA der normalisierten Werte 73
5.14 Hauptkomponentenanalyse mit zweidimensionaler Darstellung 74
6.1 Diskriminierung mit Gensignatur aus Ionenkanälen 91
9
Tabellenverzeichnis
2.1 WHO-Klassifikation der Hirntumoren (Kleihues et al. 2002) 14
2.2 Gliome und ihre WHO-Klassifikation (Kleihues et al. 2002) 16
2.3 KCN-Klassifikation der Kaliumkanäle (Gutman et al. 2003) 22
4.1 Ausgewählte Gewebeproben mit histologischem Befund 32
4.2 PCR-Bedingungen für ß-Actin 36
4.3 Beispiel einer Expressionsmatrix 44
4.4 Chemikalien und Kits 53
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4.6 Primer 54
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5.2 Zusammenfassender Überblick der Untersuchungsergebnisse 75
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