Entwicklung, Etablierung und Anwendung einer Real-Time-PCR-Methode zur Untersuchung der Relevanz einer GB-Virus-C-Infektion bei HIV-infizierten Patienten:
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2006
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| Beschreibung: | Leipzig, Univ., Diss., 2006 |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Grundlagen über die GB-Viren 1
1.1.1 Die Entdeckung des GB-Virus C (Hepatitis G Virus) 1
1.1.2 Fakten über das GB-Virus C (GBV-C) 2
1.1.3 Das relativ nah verwandte Hepatitis-C-Virus (HCV) 7
1.1.4 HIV und AIDS 8
1.1.5 Die klinische Relevanz des GB-Virus C als Krankheitserreger 11
1.1.6 Medizinische Bedeutung von GB-Virus C bei Patienten mit HIV-Infektion 12
1.2 Grundlagen zur Polymerasekettenreaktion 14
1.2.1 Das allgemeine Prinzip der Polymerasekettenreaktion (PCR) 14
1.2.2 Besonderheiten der Real-Time-PCR 15
1.2.3 Farbstoffe und Sondensysteme für die Real-Time-PCR 16
1.2.4 Funktion und Aufbau des LightCyclers® 21
1.2.5 Quantifizierungsmethoden 23
2 Zielsetzung der Arbeit 24
3 Ergebnisse 26
3.1 Ergebnisse der verschiedenen PCR-Protokolle 26
3.1.1 Allgemeine Ergebnisse zum SYBR Green-rt-PCR-System 26
3.1.2 Allgemeine Ergebnisse zum TaqMan-rt-PCR-System 31
3.2 Anwendung des Verfahrens im Rahmen von Studien 34
3.2.1 Ergebnisse einer Studie zum Vergleich verschiedener rt-PCR-Protokolle 34
3.2.2 Untersuchungen im Patientenkollektiv einer HlV-Schwerpunktpraxis 39
3.2.2.1 Untersuchung der GBV-C-Viruslast und weiterer Laborparameter 39
3.2.2.2 Untersuchung der Lebensqualität in der Kohorte 44
3.2.3 GBV-C-Status und Ansprechen auf HAART in der MaxCmini-Studie 47
3.2.4 Quantitative GBV-C-Messung in der frühen HlV-Infektionsphase 52
4 Diskussion 55
5 Patienten, Material und Methoden 64
5.1 Patienten 64
5.2 Material und Methoden 64
5.2.1 Material 64
5.2.1.1 Verwendete Geräte 64
5.2.1.2 Verbrauchsmaterialien 65
5.2.1.3 Chemikalien 65
5.2.2 Methoden 66
5.2.2.1 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren 66
5.2.2.2 Maßnahmen zur Verhütung von Degradation der eingesetzten
Nukleinsäuren und Verhinderung von Kontamination 66
5.2.2.3 Extraktion viraler RNA mittels Glasfaser-Säulen 67
5.2.2.4 Extraktion von viraler RNA mit dem MagNA Pure® LC-System 67
5.2.2.5 Klonierung zur Herstellung größerer Mengen eines DNA-Standards 68
5.2.2.6 cDNA-Synthese 69
5.2.2.7 GBV-C-Nachweis mittels Polymerasekettenreaktion 69
5.2.2.7.1 Suche nach geeigneten Primersequenzen 69
5.2.2.7.2 Die verwendete TaqMan-Sonde 69
5.2.2.7.3 Nested-PCR zum qualitativen GBV-C-Nachweis 69
5.2.2.7.4 Versuche zur Optimierung des Real-Time-PCR-Systems 70
5.2.2.7.5 Verhaltensrichtlinien zur Optimierung der Ergebnisse 71
5.2.2.7.6 GBV-C-Nachweis mittels SYBR Green als Detektionsfarbstoff 71
5.2.2.7.7 GBV-C-Nachweis mittels TaqMan-Prinzip in der Real-Time-PCR 73
5.2.2.7.8 GBV-C-Nachweis mit dem Protokoll FR-LC-1 73
5.2.2.7.9 GBV-C-Nachweis mit dem Protokoll FR-LC-1-mod 74
5.2.2.7.10 GBV-C-Nachweis mit dem Protokoll FR-LC-2 74
5.2.2.7.11 Quantifizierungsverfahren 74
5.2.2.8 Agarose-Gelelektrophorese zur Detektion von PCR-Produkten 74
5.2.2.9 ELISA zum Nachweis von GBV-C-Envelope-Antikörpern 75
5.2.2.10 Isolation von Lymphozyten aus Blut mittels Vacutainer®CPT-Röhrchen.... 75
5.2.2.11 Färbeverfahren für Lymphozyten 75
5.2.2.12 Fragebögen zu Beurteilung der Lebensqualität 76
5.2.2.13 Statistik 77
6 Zusammenfassung der Arbeit 78
7 Literaturverzeichnis 82
8 Maßeinheiten, Abkürzungen und Fachbegriffe 96
8.1 Maßeinheiten 96
8.2 Abkürzungen und Fachbegriffe 96
9 Anhang 99
9.1 Alignment von GBV-C-Teilsequenzen 99
9.2 Messergebnisse 100
9.2.1 Laborwerte der Patienten 100
9.2.1.1 Daten aus der Studie zum Vergleich verschiedener rt-PCR-Protokolle.... 100
9.3 Veröffentlichungen und Kongressbeiträge 103
9.4 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit gemäß Anlage 6
der Promotionsordnung 104
9.5 Lebenslauf 105
9.6 Danksagung 106
|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Grundlagen über die GB-Viren 1
1.1.1 Die Entdeckung des GB-Virus C (Hepatitis G Virus) 1
1.1.2 Fakten über das GB-Virus C (GBV-C) 2
1.1.3 Das relativ nah verwandte Hepatitis-C-Virus (HCV) 7
1.1.4 HIV und AIDS 8
1.1.5 Die klinische Relevanz des GB-Virus C als Krankheitserreger 11
1.1.6 Medizinische Bedeutung von GB-Virus C bei Patienten mit HIV-Infektion 12
1.2 Grundlagen zur Polymerasekettenreaktion 14
1.2.1 Das allgemeine Prinzip der Polymerasekettenreaktion (PCR) 14
1.2.2 Besonderheiten der Real-Time-PCR 15
1.2.3 Farbstoffe und Sondensysteme für die Real-Time-PCR 16
1.2.4 Funktion und Aufbau des LightCyclers® 21
1.2.5 Quantifizierungsmethoden 23
2 Zielsetzung der Arbeit 24
3 Ergebnisse 26
3.1 Ergebnisse der verschiedenen PCR-Protokolle 26
3.1.1 Allgemeine Ergebnisse zum SYBR Green-rt-PCR-System 26
3.1.2 Allgemeine Ergebnisse zum TaqMan-rt-PCR-System 31
3.2 Anwendung des Verfahrens im Rahmen von Studien 34
3.2.1 Ergebnisse einer Studie zum Vergleich verschiedener rt-PCR-Protokolle 34
3.2.2 Untersuchungen im Patientenkollektiv einer HlV-Schwerpunktpraxis 39
3.2.2.1 Untersuchung der GBV-C-Viruslast und weiterer Laborparameter 39
3.2.2.2 Untersuchung der Lebensqualität in der Kohorte 44
3.2.3 GBV-C-Status und Ansprechen auf HAART in der MaxCmini-Studie 47
3.2.4 Quantitative GBV-C-Messung in der frühen HlV-Infektionsphase 52
4 Diskussion 55
5 Patienten, Material und Methoden 64
5.1 Patienten 64
5.2 Material und Methoden 64
5.2.1 Material 64
5.2.1.1 Verwendete Geräte 64
5.2.1.2 Verbrauchsmaterialien 65
5.2.1.3 Chemikalien 65
5.2.2 Methoden 66
5.2.2.1 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren 66
5.2.2.2 Maßnahmen zur Verhütung von Degradation der eingesetzten
Nukleinsäuren und Verhinderung von Kontamination 66
5.2.2.3 Extraktion viraler RNA mittels Glasfaser-Säulen 67
5.2.2.4 Extraktion von viraler RNA mit dem MagNA Pure® LC-System 67
5.2.2.5 Klonierung zur Herstellung größerer Mengen eines DNA-Standards 68
5.2.2.6 cDNA-Synthese 69
5.2.2.7 GBV-C-Nachweis mittels Polymerasekettenreaktion 69
5.2.2.7.1 Suche nach geeigneten Primersequenzen 69
5.2.2.7.2 Die verwendete TaqMan-Sonde 69
5.2.2.7.3 Nested-PCR zum qualitativen GBV-C-Nachweis 69
5.2.2.7.4 Versuche zur Optimierung des Real-Time-PCR-Systems 70
5.2.2.7.5 Verhaltensrichtlinien zur Optimierung der Ergebnisse 71
5.2.2.7.6 GBV-C-Nachweis mittels SYBR Green als Detektionsfarbstoff 71
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5.2.2.7.8 GBV-C-Nachweis mit dem Protokoll FR-LC-1 73
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5.2.2.7.10 GBV-C-Nachweis mit dem Protokoll FR-LC-2 74
5.2.2.7.11 Quantifizierungsverfahren 74
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5.2.2.9 ELISA zum Nachweis von GBV-C-Envelope-Antikörpern 75
5.2.2.10 Isolation von Lymphozyten aus Blut mittels Vacutainer®CPT-Röhrchen. 75
5.2.2.11 Färbeverfahren für Lymphozyten 75
5.2.2.12 Fragebögen zu Beurteilung der Lebensqualität 76
5.2.2.13 Statistik 77
6 Zusammenfassung der Arbeit 78
7 Literaturverzeichnis 82
8 Maßeinheiten, Abkürzungen und Fachbegriffe 96
8.1 Maßeinheiten 96
8.2 Abkürzungen und Fachbegriffe 96
9 Anhang 99
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9.2 Messergebnisse 100
9.2.1 Laborwerte der Patienten 100
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