Untersuchungen zum Apoptose-Signalweg der Hodgkin Zelle:
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adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung und Fragestellung Seite
1.1. Morbus Hodgkin: Ein Lymphom mit besonderen Tumorzellen I
1.2. Entwicklung und Nutzen von Hodgkin Zellinien 1
1.3. Apoptose und Apoptoseresistenz 2
1.4. Apoptose im Keimzentrum 2
1.5. Zentrale Effektormechanismen der Apoptose 3
1.6. Wege der Apoptose • 4
1.6.1. Rezeptor Pathway 4
1.6.2. Mitochondrialer Pathway 4
1.6.3. Die zentrale Bedeutung der Caspase 3 5
1.6.4. Der Transkriptionsfaktor Nuclear Factor kappa B (NF kB) 5
1.6.5. Der Apoptoseinhibitor cFLIP 6
1.6.6. Die Familie der „Inhibitors of apoptosis proteins 7
1.7. Apoptose beim Hodgkin Lymphom 11
1.8. Fragestellung 12
2. Material und Methoden
2.1. Zellinien und Gewebe 13
2.1.1. Die Hodgkin Zellinie L 428 13
2.1.2. Granta 519 13
2.1.3. Bjab 13
2.1.4. Kultur der Zellinien 13
2.1.5. Gewebeschnitte 14
2.2. Inkubation mit Apoptose induzierenden Substanzen 14
2.2.1. Etoposid 14
2.2.2. TRAIL 14
1
2.2.3. Bay 11 7082 15
2.2.4. Gliotoxin 15
2.3. Western Blot 16
2.3.1. Erstellen der Zellysate 16
2.3.2. SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese(SDS PAGE) 17
2.3.3. Durchfuhrung des Western Blots 17
2.3.4. Färbung der Nitrozellulosemembran 18
2.3.5 Antikörper 19
2.3.5.1. Caspase 3 Antikörper 19
2.3.5.2. Anti FLIP, N Terminal Antikörper 19
2.3.5.3. Phospho NF KB p65 (Ser536) Antikörper 19
2.3.5.4. TRAIL Rl (DR4) Antikörper 20
2.3.5.5. TRAIL R2 (DR5) Antikörper 20
2.3.5.6. XIAP Antikörper 20
2.3.5.7. cIAP l/HIAP 2 Amikörper 20
2.4. Immunhistochemie 20
2.4.1. Antikörper 21
2.4.1.1. Caspase 3 Antikörper 21
2.4.1.2. Cleaved Caspase 3 Antikörper 22
2.4.1.3. Anti FLIPa, C Terminal Antikörper 22
2.4.1.4. MIHB/cIAP 1 Antikörper 22
2.4.1.5. MIHA/XIAP Antikörper 22
2.4.1.6. Anti NF icB p65 Antikörper 22
2.4.1.7. Phospho NF KB p65 (Ser536) Antikörper 22
2.4.2. Kontrollen und Auswertung 23
2.5. Durchflußzytometrie 23
2.6. Arbeitsmaterial 23
2.6.1. Arbeitsgeräte 23
2.6.2. Verbrauchsgüter 24
2.6.3. Antikörper 24
2.6.4. Reagenzien 25
II
3. Ergebnisse
3.1. Mechanismen zur Aktivierung der Caspase 3 27
3.1.1. Aktivierung der Caspase 3 an den in vitro kultivierten Zellinien mit 27
Etoposid
3.1.2. Rezeptorvermittelte Aktivierung der Caspase 3 an den in vitro 29
kultivierten Zellinien
3.1.2.1. Expression der TRAIL Rezeptoren an in den in vitro kultivierten 29
Zellinien
3.1.2.2. Aktivierung der Caspase 3 an den in vitro kultivierten Zellinien durch 30
Inkubation mit TRAIL
3.1.3. Aktivierung der Caspase 3 an den in vitro kultivierten Zellinien durch 31
Inhibition des Transkriptionsfaktors NF kB
3.1.3.1. Blockade des Transkriptionsfaktors NF kB mit Bay 11 7082 32
3.1.3.2. Blockade des Transkriptionsfaktors NF kB mit Bay 11 7082 und 34
Aktivierung des rezeptorvermittelten Apoptosepathways mit TRAIL
3.1.3.3. Blockade des Transkriptionsfaktors NF kB mit Gliotoxin 37
3.1.3.4. Blockade des Transkriptionsfaktors NF kB mit Gliotoxin und 38
Aktivierung des rezeptorvermittelten Apoptosepathways mit TRAIL
3.2. Der Transkriptionsfaktor NF kB und seine Regulation 39
3.2.1. Nachweis von aktiviertem NF kB 40
3.2.2. NF kB Regulation durch TRAIL 41
3.2.3. NF kB Regulation durch Bay 11 7082 42
3.2.4. NF kB Regulation durch Etoposid 43
3.3. Der Apoptoseinhibitor cFLIP und seine Regulation 43
3.3.1. Nachweis von cFLIP 44
3.3.2. Einfluß von Bay 11 7082 auf die Expression von cFLIP 44
3.4. Die Apoptoseinhibitoren cIAP 1 und XIAF und ihre Regulation 46
3.4.1. Nachweis von clAP 1 und XIAP 47
3.4.2. Einfluß von Bay 11 7082 auf die Expression von cIAP 1 und XIAP 47
3.4.3. Einfluß von Etoposid auf die Expression von cIAP 1 und XIAP 49
III
4. Diskussion
4.1. Aktivierung der Caspase 3 über den mitochondrialen Apoptose 51
Pathway
4.2. Aktivierung der Caspase 3 über den rezeptorvermittelten 51
Apoptose Pathway
4.3. Aktivierung der Caspase 3 über Inhibition des antiapoptotisch 53
wirksamen Transkriptionsfaktors NF kB
4.4. Regulation des Transkriptionsfaktors NF kB 54
4.5. Regulation des Apoptoseinhibitors cFLIP 56
4.6. Regulation der Apoptoseinhibitoren cIAP 1 und XIAP 56
5. Zusammenfassung 58
6. Literaturverzeichnis 59
Danksagung 63
Lebenslauf 66
IV
|
adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung und Fragestellung Seite
1.1. Morbus Hodgkin: Ein Lymphom mit besonderen Tumorzellen I
1.2. Entwicklung und Nutzen von Hodgkin Zellinien 1
1.3. Apoptose und Apoptoseresistenz 2
1.4. Apoptose im Keimzentrum 2
1.5. Zentrale Effektormechanismen der Apoptose 3
1.6. Wege der Apoptose • 4
1.6.1. Rezeptor Pathway 4
1.6.2. Mitochondrialer Pathway 4
1.6.3. Die zentrale Bedeutung der Caspase 3 5
1.6.4. Der Transkriptionsfaktor Nuclear Factor kappa B (NF kB) 5
1.6.5. Der Apoptoseinhibitor cFLIP 6
1.6.6. Die Familie der „Inhibitors of apoptosis proteins" 7
1.7. Apoptose beim Hodgkin Lymphom 11
1.8. Fragestellung 12
2. Material und Methoden
2.1. Zellinien und Gewebe 13
2.1.1. Die Hodgkin Zellinie L 428 13
2.1.2. Granta 519 13
2.1.3. Bjab 13
2.1.4. Kultur der Zellinien 13
2.1.5. Gewebeschnitte 14
2.2. Inkubation mit Apoptose induzierenden Substanzen 14
2.2.1. Etoposid 14
2.2.2. TRAIL 14
1
2.2.3. Bay 11 7082 15
2.2.4. Gliotoxin 15
2.3. Western Blot 16
2.3.1. Erstellen der Zellysate 16
2.3.2. SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese(SDS PAGE) 17
2.3.3. Durchfuhrung des Western Blots 17
2.3.4. Färbung der Nitrozellulosemembran 18
2.3.5 Antikörper 19
2.3.5.1. Caspase 3 Antikörper 19
2.3.5.2. Anti FLIP, N Terminal Antikörper 19
2.3.5.3. Phospho NF KB p65 (Ser536) Antikörper 19
2.3.5.4. TRAIL Rl (DR4) Antikörper 20
2.3.5.5. TRAIL R2 (DR5) Antikörper 20
2.3.5.6. XIAP Antikörper 20
2.3.5.7. cIAP l/HIAP 2 Amikörper 20
2.4. Immunhistochemie 20
2.4.1. Antikörper 21
2.4.1.1. Caspase 3 Antikörper 21
2.4.1.2. Cleaved Caspase 3 Antikörper 22
2.4.1.3. Anti FLIPa, C Terminal Antikörper 22
2.4.1.4. MIHB/cIAP 1 Antikörper 22
2.4.1.5. MIHA/XIAP Antikörper 22
2.4.1.6. Anti NF icB p65 Antikörper 22
2.4.1.7. Phospho NF KB p65 (Ser536) Antikörper 22
2.4.2. Kontrollen und Auswertung 23
2.5. Durchflußzytometrie 23
2.6. Arbeitsmaterial 23
2.6.1. Arbeitsgeräte 23
2.6.2. Verbrauchsgüter 24
2.6.3. Antikörper 24
2.6.4. Reagenzien 25
II
3. Ergebnisse
3.1. Mechanismen zur Aktivierung der Caspase 3 27
3.1.1. Aktivierung der Caspase 3 an den in vitro kultivierten Zellinien mit 27
Etoposid
3.1.2. Rezeptorvermittelte Aktivierung der Caspase 3 an den in vitro 29
kultivierten Zellinien
3.1.2.1. Expression der TRAIL Rezeptoren an in den in vitro kultivierten 29
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3.1.2.2. Aktivierung der Caspase 3 an den in vitro kultivierten Zellinien durch 30
Inkubation mit TRAIL
3.1.3. Aktivierung der Caspase 3 an den in vitro kultivierten Zellinien durch 31
Inhibition des Transkriptionsfaktors NF kB
3.1.3.1. Blockade des Transkriptionsfaktors NF kB mit Bay 11 7082 32
3.1.3.2. Blockade des Transkriptionsfaktors NF kB mit Bay 11 7082 und 34
Aktivierung des rezeptorvermittelten Apoptosepathways mit TRAIL
3.1.3.3. Blockade des Transkriptionsfaktors NF kB mit Gliotoxin 37
3.1.3.4. Blockade des Transkriptionsfaktors NF kB mit Gliotoxin und 38
Aktivierung des rezeptorvermittelten Apoptosepathways mit TRAIL
3.2. Der Transkriptionsfaktor NF kB und seine Regulation 39
3.2.1. Nachweis von aktiviertem NF kB 40
3.2.2. NF kB Regulation durch TRAIL 41
3.2.3. NF kB Regulation durch Bay 11 7082 42
3.2.4. NF kB Regulation durch Etoposid 43
3.3. Der Apoptoseinhibitor cFLIP und seine Regulation 43
3.3.1. Nachweis von cFLIP 44
3.3.2. Einfluß von Bay 11 7082 auf die Expression von cFLIP 44
3.4. Die Apoptoseinhibitoren cIAP 1 und XIAF und ihre Regulation 46
3.4.1. Nachweis von clAP 1 und XIAP 47
3.4.2. Einfluß von Bay 11 7082 auf die Expression von cIAP 1 und XIAP 47
3.4.3. Einfluß von Etoposid auf die Expression von cIAP 1 und XIAP 49
III
4. Diskussion
4.1. Aktivierung der Caspase 3 über den mitochondrialen Apoptose 51
Pathway
4.2. Aktivierung der Caspase 3 über den rezeptorvermittelten 51
Apoptose Pathway
4.3. Aktivierung der Caspase 3 über Inhibition des antiapoptotisch 53
wirksamen Transkriptionsfaktors NF kB
4.4. Regulation des Transkriptionsfaktors NF kB 54
4.5. Regulation des Apoptoseinhibitors cFLIP 56
4.6. Regulation der Apoptoseinhibitoren cIAP 1 und XIAP 56
5. Zusammenfassung 58
6. Literaturverzeichnis 59
Danksagung 63
Lebenslauf 66
IV |
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