DNA-Vakzinierung am Rattenmodell: Modulation und Differenzierung der Anti-Tumor-Antwort
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adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG 1
1. Gliome 1
2. DNA-Vakzinierung 2
3. CpG-Oligodeoxynukleotide 5
II AUFGABENSTELLUNG 6
III MATERIAL UND METHODEN 7
1. Zelllinien und Zellkultur 7
2. Versuchstiere 7
3. Vakzinierungsvektoren 8
4. Plasmidpräparation 9
4.1. Transfektion von E.coli-Bakterien 9
4.2. Testpräparation mittels Mini-Prep®-Kit der Firma Qiagen 9
4.3. Qualitätsbestimmung mittels Gelelektrophorese 10
4.4. Herstellung großer DNA-Mengen mittels Giga-Prep® 10
5. Oligodeoxynukleotide 11
6. Vakzinierung der Tiere 11
7. Tumorzellimplantation 11
7.1. Vorbereitung der Zellen 11
7.2. Intrakranielle Implantation 12
7.3. Intratumorale CpG-ODN Injektion 13
8. Auswertung 13
8.1. Organentnahme 13
8.2. Berechnung der Tumorvolumina 13
8.3. Anfertigung von Gefrierschnitten aus Rattengehirnen 13
8.4. Histologische Färbemethoden 14
8.4.1. Hämalaun-Eosin-Färbung 14
8.4.2. X-Gal-Färbung 14
8.4.3. Immunhistochemie 14
8.4.3.1. Verwendete Antikörper 14
8.4.3.2. Durchführung 17
8.5. Funktionelle Untersuchungsmethoden 17
8.5.1. Gewinnung T-Zell-angereicherter mononukleärer 17
Zellen aus Rattenmilzen
8.5.2. CTLAssay 18
8.5.2.1. Herstellung spezifischer CTL 18
8.5.2.2. Zytotoxizitätsmessung im
51Cr-Freisetzungstest 18
8.5.2.3. Antikörper vermittelte Blockade
der spezifischen Zytolyse 19
8.5.2.4. Durchflußzytometrische Untersuchung
der Effektorzellen 20
8.5.3. Messung der IFNy-Synthese mittels
ELISPOT-Assay 20
9. Statistik 21
IV ERGEBNISSE 22
1. Histo-Morphologische Beschreibung des 9L/lacZ-Gliosarkoms 22
2. Darstellung der Tumorvolumina und lacZ-Expression der Tumoren 23
2.1. Tumorvolumenbestimmung an HE-gefärbten Schnitten 23
2.1.1. Wirkung von plL-12 und pflt3-ügand 23
2.1.2. Abhängigkeit der Tumorgröße
von injizierter Zellzahl 24
2.1.3. CpG-ODN als lokales Adjuvans 25
2.2. Histologische und Zytologische Darstellung
der lacZ-Expression 27
3. Immunhistochemische Untersuchung der lymphozytären Infiltrate 28
3.1. Charakterisierung des T-Zell-Infiltrates:
TCR-, CD4- und CD8-Expression 28
3.2. Darstellung von NK-Zellen 30
3.3. Aktivierungsstatus des Infiltrates 30
4. Immunhistochemische Untersuchung der Mikroglia 31
4.1. Darstellung der Iba1 Expression 31
4.2. Darstellung der MHC II Expression 32
4.3. Untersuchung auf Expression des ED1-Antigens 33
5. Zytotoxizitätsmessung von Splenozyten im 51Cr-Freisetzungstest 34
5.1. Darstellung der Lyseraten 34
5.2. Korrelation von Tumorvolumen mit maximaler
spezifischer Lyse 37
5.3. Inhibition der zytotoxischen Aktivität durch verschiedene
Antikörper 38
5.4. Durchflusszytometrische Untersuchung der Effektorzellen 39
6. Messung der IFNy-Synthese von Splenozyten im ELISPOT-Assay 41
6.1. IFNy-Synthese nach lacZ-Vakzinierung 41
6.2. Reaktion von CpG-ODN auf die IFNy-Synthese 42
V DISKUSSION 44
1. Induktion einer Anti-Tumor Antwort durch DNA Vakzinierung 44
2. Beeinflussung der Anti-Tumor Antwort durch Koapplikation
von Zytokinen 45
3. Beeinflussung der Anti-Tumor Antwort durch CpG-ODN 47
4. Morphologische Charakterisierung der Anti-Tumor Antwort 48
4.1. T-und NK-Zellen 48
4.2. Mikroglia 50
5. Funktionelle Charakterisierung der Anti-Tumor Antwort 52
6. Ausblick 54
VI ZUSAMMENFASSUNG 55
VII LITERATURVERZEICHNIS 57
VIII DANKSAGUNG 68
IX LEBENSLAUF 69
|
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INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG 1
1. Gliome 1
2. DNA-Vakzinierung 2
3. CpG-Oligodeoxynukleotide 5
II AUFGABENSTELLUNG 6
III MATERIAL UND METHODEN 7
1. Zelllinien und Zellkultur 7
2. Versuchstiere 7
3. Vakzinierungsvektoren 8
4. Plasmidpräparation 9
4.1. Transfektion von E.coli-Bakterien 9
4.2. Testpräparation mittels Mini-Prep®-Kit der Firma Qiagen 9
4.3. Qualitätsbestimmung mittels Gelelektrophorese 10
4.4. Herstellung großer DNA-Mengen mittels Giga-Prep® 10
5. Oligodeoxynukleotide 11
6. Vakzinierung der Tiere 11
7. Tumorzellimplantation 11
7.1. Vorbereitung der Zellen 11
7.2. Intrakranielle Implantation 12
7.3. Intratumorale CpG-ODN Injektion 13
8. Auswertung 13
8.1. Organentnahme 13
8.2. Berechnung der Tumorvolumina 13
8.3. Anfertigung von Gefrierschnitten aus Rattengehirnen 13
8.4. Histologische Färbemethoden 14
8.4.1. Hämalaun-Eosin-Färbung 14
8.4.2. X-Gal-Färbung 14
8.4.3. Immunhistochemie 14
8.4.3.1. Verwendete Antikörper 14
8.4.3.2. Durchführung 17
8.5. Funktionelle Untersuchungsmethoden 17
8.5.1. Gewinnung T-Zell-angereicherter mononukleärer 17
Zellen aus Rattenmilzen
8.5.2. CTLAssay 18
8.5.2.1. Herstellung spezifischer CTL 18
8.5.2.2. Zytotoxizitätsmessung im
51Cr-Freisetzungstest 18
8.5.2.3. Antikörper vermittelte Blockade
der spezifischen Zytolyse 19
8.5.2.4. Durchflußzytometrische Untersuchung
der Effektorzellen 20
8.5.3. Messung der IFNy-Synthese mittels
ELISPOT-Assay 20
9. Statistik 21
IV ERGEBNISSE 22
1. Histo-Morphologische Beschreibung des 9L/lacZ-Gliosarkoms 22
2. Darstellung der Tumorvolumina und lacZ-Expression der Tumoren 23
2.1. Tumorvolumenbestimmung an HE-gefärbten Schnitten 23
2.1.1. Wirkung von plL-12 und pflt3-ügand 23
2.1.2. Abhängigkeit der Tumorgröße
von injizierter Zellzahl 24
2.1.3. CpG-ODN als lokales Adjuvans 25
2.2. Histologische und Zytologische Darstellung
der lacZ-Expression 27
3. Immunhistochemische Untersuchung der lymphozytären Infiltrate 28
3.1. Charakterisierung des T-Zell-Infiltrates:
TCR-, CD4- und CD8-Expression 28
3.2. Darstellung von NK-Zellen 30
3.3. Aktivierungsstatus des Infiltrates 30
4. Immunhistochemische Untersuchung der Mikroglia 31
4.1. Darstellung der Iba1 Expression 31
4.2. Darstellung der MHC II Expression 32
4.3. Untersuchung auf Expression des ED1-Antigens 33
5. Zytotoxizitätsmessung von Splenozyten im 51Cr-Freisetzungstest 34
5.1. Darstellung der Lyseraten 34
5.2. Korrelation von Tumorvolumen mit maximaler
spezifischer Lyse 37
5.3. Inhibition der zytotoxischen Aktivität durch verschiedene
Antikörper 38
5.4. Durchflusszytometrische Untersuchung der Effektorzellen 39
6. Messung der IFNy-Synthese von Splenozyten im ELISPOT-Assay 41
6.1. IFNy-Synthese nach lacZ-Vakzinierung 41
6.2. Reaktion von CpG-ODN auf die IFNy-Synthese 42
V DISKUSSION 44
1. Induktion einer Anti-Tumor Antwort durch DNA Vakzinierung 44
2. Beeinflussung der Anti-Tumor Antwort durch Koapplikation
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3. Beeinflussung der Anti-Tumor Antwort durch CpG-ODN 47
4. Morphologische Charakterisierung der Anti-Tumor Antwort 48
4.1. T-und NK-Zellen 48
4.2. Mikroglia 50
5. Funktionelle Charakterisierung der Anti-Tumor Antwort 52
6. Ausblick 54
VI ZUSAMMENFASSUNG 55
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