Aktivierung tumorspezifischer T-Zellen durch Kokultivierung humaner dendritischer Zellen mit autologen kolorektalen Karzinomzellen:
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2006
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis Seite
Abkürzungsverzeichnis 1
1. Einleitung 3
1.1. Das kolorektale Karzinom 3
1.1.1. Epidemiologie 3
1.1.2. Ätiologie 3
1.1.3. Prävention 5
1.1.4. Lokalisation, Histologie und Stadieneinteilung 7
1.1.5. Therapie 9
1.2. Zelluläre immuntherapeutische Ansätze Grundlagen 12
1.2.1. Wie entgehen Tumorzellen der Immunantwort? 12
1.2.2. Dendritische Zellen als professionelle Antigen präsentierende 12
Zellen
1.2.3. Die Präsentation exogener und endogener Antigene durch 13
dendritische Zellen
1.2.4. Die Reifung dendritischer Zellen und die Induktion 15
tumorspezifischer T Zell Antworten
1.3. Aktive zelluläre immuntherapeutische Ansätze Stand der 17
Forschung
1.3.1. Strategien zur Präsentation multipler Tumor assoziierter 20
Antigene durch Antigen präsentierende Zellen
1.4. Ziele dieser Dissertationsarbeit 22
1.4.1. Kann durch die Kokultivierung von autologen dendritischen 22
Zellen und Tumorzellen eine spezifische zytotoxische
Immunantwort generiert werden?
1.4.2. Welche Mechanismen liegen der Präsentation von Tumor 23
assoziierten Antigenen nach Kokultivierung zugrunde?
I
2. Material und Methoden 24
2.1. Zelllinie K562 und Kulturbedingungen 24
2.2. Bestimmung der Zellkonzentration 24
2.3. Primärmaterial 25
2.3.1. Aufarbeitung des Tumormaterials 25
2.3.2. Gewinnung peripherer mononukleärer Zellen 26
2.3.3. Immunomagneu sche Zellseparation zur Anreicherung CD14+ 27
Zellen
2.3.4. Generierung dendritischer Zellen aus peripherem Blut und 27
deren Reifung zu Antigen präsentierenden Zellen
2.4. Phänotypisierung von Zellen mittels Durchflusszytometrie 28
2.5. Kokultivierung von dendritischen Zellen, Tumorzellen und 29
vorstimulierten peripheren mononukleären Zellen
2.6. Bestimmung spezifischer T Zell Antworten in 29
Zytotoxizitätsassays
2.7. Durchflusszytometrische Untersuchungen nach Kokultivierung 32
beziehungsweise Zellfusion fluoreszenzmarkierter dendritischer
Zellen und kolorektaler Tumorzellen
2.8. Bestimmung des Anteils an nekrotischen beziehungsweise 34
apoptotischen Tumorzellen
2.9. Fluoreszenzmikroskopische Analysen nach Kokultivierung von 34
dendritischen Zellen und kolorektalen Karzinomzellen
3. Ergebnisse 36
3.1. Generierung und Phänotyp Antigen präsentierender dendritischer 36
Zellen von Patienten mit kolorektalem Karzinom
3.2. Induktion spezifischer zytotoxischer Immunantworten durch 37
dendritische Zellen nach Kokultivierung mit autologen
Tumorzellen
3.2.1. Ausschluss einer relevanten NK Zell Aktivität bei der 39
zytotoxischen Immunantwort gegen kolorektale
Karzinomzellen
3.2.2. Die beobachtete Immunantwort ist MHC I restringiert 42
3.3. Untersuchungen zur Prozessierung von Tumor assoziierten 43
Antigenen durch autologe dendritische Zellen nach einfacher
Kokultivierung mit Tumorzellen
3.3.1. Untersuchungen zur Effizienz der Aufnahme von 44
Tumorbestandteilen durch dendritische Zellen nach einfacher
Kokultivierung mit autologen kolorektalen Karzinomzellen
3.3.2. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen nach 48
Kokultivierung von dendritischen Zellen mit autologen
kolorektalen Karzinomzellen
3.3.3. Bestimmung des Anteils apoptotischer und nekrotischer 51
kolorektaler Zellen unter den gewählten
Kokulti vierungsbedingungen
4. Diskussion 54
4.1. Effizienz der einfachen Kokultivierungsstrategie zur Generierung 55
Tumor assoziierte Antigen prozessierender dendritischer Zellen
im Vergleich zu einer Zellfusion
4.2. Mögliche Mechanismen, die eine Tumorantigenprozessierung 58
durch dendritische Zellen im untersuchten System ermöglichen
4.2.1. „Priming von dendritischen Zellen mit Tumorzellen oder 58
Tumorzellpräparationen Strategien und deren Effizienz
4.2.2. Apoptotische kolorektale Karzinomzellen als mögliches 60
Substrat für die Aufnahme und Tumorantigenprozessierung
durch autologe dendritische Zellen
4.2.3. Phagozytose von Tumorzellen oder Tumorzellbestandteilen als 61
wahrscheinlichster Mechanismus zur Cross Prasentation von
Tumor assoziierten Antigenen
m
4.3. Induktion tumorspezifischer zytotoxischer T Zellen durch die 62
Kokultivierungsstrategie im vorgestellten System kolorektaler
Karzinome
4.4. Bewertung der beobachteten T Zell Aktivierung bezüglich des 64
untersuchten Patientengutes
4.5. Zusammenfassende Diskussion der beobachteten Induktion 65
tumorspezifischer T Zellen nach Kokultivierung von
dendritischen Zellen mit autologen kolorektalen Karzinomzellen
und Ausblick
5. Zusammenfassung 68
6. Literaturverzeichnis 69
7. Anhang 92 ^
7.1. Patientendaten und jeweils durchgeführte Experimente 92
7.2. Effizienz der Kokultivierung sowie der Zellfusion nach 93
Färbungen mit den Membranfarbstoffen DilC und DiOC
7.2.1. Kokultivierung von Tumorzellen mit autologen dendritischen 93
Zellen
7.2.2. Zellfusion von Tumorzellen und autologen dendritischen 94
Zellen
7.3. Kokultivierung und Fusion von kolorektalen Tumorzellen und 95
allogenen dendritischen Zellen nach Färbungen mit den
Membranfarbstoffen DilC und DiOC mit und ohne Trennung
durch einen Membranfilter
7.4. Annexin V /Propidiumjodid sowie Trypanblau Färbungen von 97
Tumorzellen nach 24 stündiger Kultur unter serumfreien
Bedingungen
7.5. Zytotoxizitätsassays 98
7.5.1. Zytotoxizitätsversuche bei steigenden Zielzell 98
/EfFektorzellrelationen
7.5.2. Nachweis von Spezifität und MHC I Restriktion in den 99
Zytotoxizitätsversuchen sowie Kontrollversuch mit K 562
Zielzellen
8. Lebenslauf 101
V
|
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Inhaltsverzeichnis Seite
Abkürzungsverzeichnis 1
1. Einleitung 3
1.1. Das kolorektale Karzinom 3
1.1.1. Epidemiologie 3
1.1.2. Ätiologie 3
1.1.3. Prävention 5
1.1.4. Lokalisation, Histologie und Stadieneinteilung 7
1.1.5. Therapie 9
1.2. Zelluläre immuntherapeutische Ansätze Grundlagen 12
1.2.1. Wie entgehen Tumorzellen der Immunantwort? 12
1.2.2. Dendritische Zellen als professionelle Antigen präsentierende 12
Zellen
1.2.3. Die Präsentation exogener und endogener Antigene durch 13
dendritische Zellen
1.2.4. Die Reifung dendritischer Zellen und die Induktion 15
tumorspezifischer T Zell Antworten
1.3. Aktive zelluläre immuntherapeutische Ansätze Stand der 17
Forschung
1.3.1. Strategien zur Präsentation multipler Tumor assoziierter 20
Antigene durch Antigen präsentierende Zellen
1.4. Ziele dieser Dissertationsarbeit 22
1.4.1. Kann durch die Kokultivierung von autologen dendritischen 22
Zellen und Tumorzellen eine spezifische zytotoxische
Immunantwort generiert werden?
1.4.2. Welche Mechanismen liegen der Präsentation von Tumor 23
assoziierten Antigenen nach Kokultivierung zugrunde?
I
2. Material und Methoden 24
2.1. Zelllinie K562 und Kulturbedingungen 24
2.2. Bestimmung der Zellkonzentration 24
2.3. Primärmaterial 25
2.3.1. Aufarbeitung des Tumormaterials 25
2.3.2. Gewinnung peripherer mononukleärer Zellen 26
2.3.3. Immunomagneu'sche Zellseparation zur Anreicherung CD14+ 27
Zellen
2.3.4. Generierung dendritischer Zellen aus peripherem Blut und 27
deren Reifung zu Antigen präsentierenden Zellen
2.4. Phänotypisierung von Zellen mittels Durchflusszytometrie 28
2.5. Kokultivierung von dendritischen Zellen, Tumorzellen und 29
vorstimulierten peripheren mononukleären Zellen
2.6. Bestimmung spezifischer T Zell Antworten in 29
Zytotoxizitätsassays
2.7. Durchflusszytometrische Untersuchungen nach Kokultivierung 32
beziehungsweise Zellfusion fluoreszenzmarkierter dendritischer
Zellen und kolorektaler Tumorzellen
2.8. Bestimmung des Anteils an nekrotischen beziehungsweise 34
apoptotischen Tumorzellen
2.9. Fluoreszenzmikroskopische Analysen nach Kokultivierung von 34
dendritischen Zellen und kolorektalen Karzinomzellen
3. Ergebnisse 36
3.1. Generierung und Phänotyp Antigen präsentierender dendritischer 36
Zellen von Patienten mit kolorektalem Karzinom
3.2. Induktion spezifischer zytotoxischer Immunantworten durch 37
dendritische Zellen nach Kokultivierung mit autologen
Tumorzellen
3.2.1. Ausschluss einer relevanten NK Zell Aktivität bei der 39
zytotoxischen Immunantwort gegen kolorektale
Karzinomzellen
3.2.2. Die beobachtete Immunantwort ist MHC I restringiert 42
3.3. Untersuchungen zur Prozessierung von Tumor assoziierten 43
Antigenen durch autologe dendritische Zellen nach einfacher
Kokultivierung mit Tumorzellen
3.3.1. Untersuchungen zur Effizienz der Aufnahme von 44
Tumorbestandteilen durch dendritische Zellen nach einfacher
Kokultivierung mit autologen kolorektalen Karzinomzellen
3.3.2. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen nach 48
Kokultivierung von dendritischen Zellen mit autologen
kolorektalen Karzinomzellen
3.3.3. Bestimmung des Anteils apoptotischer und nekrotischer 51
kolorektaler Zellen unter den gewählten
Kokulti vierungsbedingungen
4. Diskussion 54
4.1. Effizienz der einfachen Kokultivierungsstrategie zur Generierung 55
Tumor assoziierte Antigen prozessierender dendritischer Zellen
im Vergleich zu einer Zellfusion
4.2. Mögliche Mechanismen, die eine Tumorantigenprozessierung 58
durch dendritische Zellen im untersuchten System ermöglichen
4.2.1. „Priming" von dendritischen Zellen mit Tumorzellen oder 58
Tumorzellpräparationen Strategien und deren Effizienz
4.2.2. Apoptotische kolorektale Karzinomzellen als mögliches 60
Substrat für die Aufnahme und Tumorantigenprozessierung
durch autologe dendritische Zellen
4.2.3. Phagozytose von Tumorzellen oder Tumorzellbestandteilen als 61
wahrscheinlichster Mechanismus zur Cross Prasentation von
Tumor assoziierten Antigenen
m
4.3. Induktion tumorspezifischer zytotoxischer T Zellen durch die 62
Kokultivierungsstrategie im vorgestellten System kolorektaler
Karzinome
4.4. Bewertung der beobachteten T Zell Aktivierung bezüglich des 64
untersuchten Patientengutes
4.5. Zusammenfassende Diskussion der beobachteten Induktion 65
tumorspezifischer T Zellen nach Kokultivierung von
dendritischen Zellen mit autologen kolorektalen Karzinomzellen
und Ausblick
5. Zusammenfassung 68
6. Literaturverzeichnis 69
7. Anhang 92 ^
7.1. Patientendaten und jeweils durchgeführte Experimente 92
7.2. Effizienz der Kokultivierung sowie der Zellfusion nach 93
Färbungen mit den Membranfarbstoffen DilC und DiOC
7.2.1. Kokultivierung von Tumorzellen mit autologen dendritischen 93
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7.2.2. Zellfusion von Tumorzellen und autologen dendritischen 94
Zellen
7.3. Kokultivierung und Fusion von kolorektalen Tumorzellen und 95
allogenen dendritischen Zellen nach Färbungen mit den
Membranfarbstoffen DilC und DiOC mit und ohne Trennung
durch einen Membranfilter
7.4. Annexin V /Propidiumjodid sowie Trypanblau Färbungen von 97
Tumorzellen nach 24 stündiger Kultur unter serumfreien
Bedingungen
7.5. Zytotoxizitätsassays 98
7.5.1. Zytotoxizitätsversuche bei steigenden Zielzell 98
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8. Lebenslauf 101
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