Nachweis residualer Virusreplikation bei Patienten mit einer HIV-1-Infektion unter einer bestehenden HAART:
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2006
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 HIV 1
1.1.1 Entstehung und Verbreitung der HIV Infektion 1
1.1.2 Taxonomie von HIV 1
1.1.3 Aufbau des Virus 1
1.1.4 Replikationszyklus 2
1.1.4.1 Infektion 2
1.1.4.2 Replikation 2
1.1.5 HIV und Immunsystem 3
1.2 HIV Therapie 3
1.2.1 Medikamentengruppen 4
1.2.1.1 Nukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren (NRTI) 4
1.2.1.1.1 Wirkungsweise 4
1.2.1.1.2 Nebenwirkungen 4
1.2.1.2 Nicht Nukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren (NNRTI) 5
1.2.1.2.1 Wirkungsweise 5
1.2.1.2.2 Nebenwirkungen 5
1.2.1.3 Proteaseinhibitoren (PI) 5
1.2.1.3.1 Wirkungsweise 5
1.2.1.3.2 Nebenwirkungen 5
1.2.1.4 Entry Inhibitoren (EI) 6
1.2.2 Therapiestrategien 6
1.2.2.1 Drei Nukleosid bzw. Nukleotidanaloga 6
1.2.2.1.1 Therapievorteile 6
1.2.2.1.2 Therapienachteile 6
1.2.2.2 Zwei Nukleosidanaloga plus ein NNRTI 6
1.2.2.2.1 Therapievorteile 6
1.2.2.2.2 Therapienachteile 6
1.2.2.3 Zwei Nukleosidanaloga plus ein PI 7
1.2.2.3.1 Therapievorteile 7
1.2.2.3.2 Therapienachteile 7
1.3 Problematik der Resistenzentwicklung 7
1.4 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 8
2 Material und Methoden 10
2.1 Biologisches Material 10
2.1.1 Patientenkollektiv 10
2.1.1.1 Kollektiv 1: 10
2.1.1.2 Kollektiv 2: 10
2.1.1.3 Patientencharakteristik 10
2.2 Nichtbiologisches Material 11
2.2.1 Geräte 11
2.2.2 Lösungen und Puffer 12
2.2.2.1 Reagenzien zur Isolierung und Kryokonservierung der PBMCs sowie
Zellfraktionierung 12
2.2.2.2 Reagenzien zur RNA Isolienmg und Agarose Gelelektrophorese 12
222.3 Reagenzien zur Sequenzierung 12
2.2.3 Reagenziensysteme 13
2.2.4 Oligonukleotide 13
2.2.4.1 pol PCR ...„ 13
I
2.2.4.2 integrase fCK 13
2.2.4.3 Oligonukleotide für die Sequenzierung 13
2.2.5 Elektronische Auswertungshilfen und Server 13
2.3 Methoden I3
2.3.1 Bestimmung der Plasmaviruslast 13
2.3.2 Isolierung und Kryokonservienmg von peripheral blood mononuclear
ceUs(PBMC) 14
2.3.3 Zellfraktionierung mittels Dynal Beads 14
2.3.4 RNA Präparation 15
2.3.5 Reverse Transkription (RT) und Polymerasekettenreatkion (PCR) 16
2.3.5.1 RT 16
2.3.5.2 PCR 16
2.3.5.2.1 One Step RT PCR 17
2.3.5.2.2 Hot Start RT PCR 17
2.3.5.2.3 Nested RT PCR 17
2.3.5.2.4 Touchdown RT PCR —,.—.. 17
2.3.5.3 Pipettierschemata und Thennocyclerbedingungen für die
Amplifikation der HIV 1 po/ Abschmtte 18
2.3.5.3.1 One step RT PCR Pipettierschema: 18
2.3.5.3.2 One Step RT PCR Programm im T3 Thermocycler (Biometra) 18
2.3.5.3.3 Nested RT PCR Pipettierschema 18
2.3.5.3.4 Nested RT PCR Programm im T3 Thermocycler (Biometra) 19
2.3.5.4 Kontroll PCR HIV 1 DNA 19
2.3.5.4.1 One Step PCR Pipettierschema: 19
2.3.5.4.2 One Step PCR Programm im T3 Thermocycler (Biometra) 19
2.3.5.4.3 Nested PCR Pipettierschema 20
2.3.5.4.4 Nested PCR Programm im T3 Thermocycler (Biometra) 20
2.3.5.5 Pipettierschemata und Thennocyclerbedingungen für die
Amplifikation des integrase Abschnittes 20
2.3.5.5.1 Pipettierschema für integrase RT PCR 20
2.3.5.5.2 Programm im T3 Thermocycler (Biometra) für integrase RT PCR 20
2.3.5.5.3 Endpunktverdünnung zur Abschätzung der Sensitivität der
Intergrase RT PCR 21
2.3.6 Agarose Gelelektrophorese 21
2.3.7 Sequenzierung 22
2.3.8 Sequenzanalyse . 23
2.3.8.1 Sequenzierung mit dem ABI PRISM™ 310 Genetic Analyser 23
2.3.8.1.1 Ansatz für HIV 1 pol Sequenzierung 24
2.3.8.1.2 Sequenzreaktion: 24
2.3.8.2 Rechnergestützte Methoden zur Sequenz Auswertung 24
2.3.8.2.1 Erstellung von Konsensussequenzen 24
3 Ergebnisse 25
3.1 Nachweis des PCR Produkts der pol Region 26
3.2 Sequenzierung und Sequenzauswertung der pol Region 28
3.3 Nachweis der viralen RNA mit der integrase PCR 30
3.3.1 Vergleich der residualen Virusreplikation mittels integrase PCR 31
4 Diskussion 34
4.1 Virusreplikation in den mononukleären Zellen des peripheren Blutes unter
einer erfolgreichen HAART 34
4.2 Nachweis des PCR Produkts derpol Region 35
4.3 Resistenzassoziierte Mutationen der pol Region 36
n
4.4 Nachweis der viralen RNA mit der integrase PCR 37
4.4.1 Vergleich der residualen Virusreplikation mittels integrase VCR 37
5 Zusammenfassung 39
6 Literaturverzeichnis 40
7 Anhang 44
Lebenslauf 47
m
|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 HIV 1
1.1.1 Entstehung und Verbreitung der HIV Infektion 1
1.1.2 Taxonomie von HIV 1
1.1.3 Aufbau des Virus 1
1.1.4 Replikationszyklus 2
1.1.4.1 Infektion 2
1.1.4.2 Replikation 2
1.1.5 HIV und Immunsystem 3
1.2 HIV Therapie 3
1.2.1 Medikamentengruppen 4
1.2.1.1 Nukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren (NRTI) 4
1.2.1.1.1 Wirkungsweise 4
1.2.1.1.2 Nebenwirkungen 4
1.2.1.2 Nicht Nukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren (NNRTI) 5
1.2.1.2.1 Wirkungsweise 5
1.2.1.2.2 Nebenwirkungen 5
1.2.1.3 Proteaseinhibitoren (PI) 5
1.2.1.3.1 Wirkungsweise 5
1.2.1.3.2 Nebenwirkungen 5
1.2.1.4 Entry Inhibitoren (EI) 6
1.2.2 Therapiestrategien 6
1.2.2.1 Drei Nukleosid bzw. Nukleotidanaloga 6
1.2.2.1.1 Therapievorteile 6
1.2.2.1.2 Therapienachteile 6
1.2.2.2 Zwei Nukleosidanaloga plus ein NNRTI 6
1.2.2.2.1 Therapievorteile 6
1.2.2.2.2 Therapienachteile 6
1.2.2.3 Zwei Nukleosidanaloga plus ein PI 7
1.2.2.3.1 Therapievorteile 7
1.2.2.3.2 Therapienachteile 7
1.3 Problematik der Resistenzentwicklung 7
1.4 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 8
2 Material und Methoden 10
2.1 Biologisches Material 10
2.1.1 Patientenkollektiv 10
2.1.1.1 Kollektiv 1: 10
2.1.1.2 Kollektiv 2: 10
2.1.1.3 Patientencharakteristik 10
2.2 Nichtbiologisches Material 11
2.2.1 Geräte 11
2.2.2 Lösungen und Puffer 12
2.2.2.1 Reagenzien zur Isolierung und Kryokonservierung der PBMCs sowie
Zellfraktionierung 12
2.2.2.2 Reagenzien zur RNA Isolienmg und Agarose Gelelektrophorese 12
222.3 Reagenzien zur Sequenzierung 12
2.2.3 Reagenziensysteme 13
2.2.4 Oligonukleotide 13
2.2.4.1 pol PCR .„ 13
I
2.2.4.2 integrase fCK 13
2.2.4.3 Oligonukleotide für die Sequenzierung 13
2.2.5 Elektronische Auswertungshilfen und Server 13
2.3 Methoden I3
2.3.1 Bestimmung der Plasmaviruslast 13
2.3.2 Isolierung und Kryokonservienmg von peripheral blood mononuclear
ceUs(PBMC) 14
2.3.3 Zellfraktionierung mittels Dynal Beads 14
2.3.4 RNA Präparation 15
2.3.5 Reverse Transkription (RT) und Polymerasekettenreatkion (PCR) 16
2.3.5.1 RT 16
2.3.5.2 PCR 16
2.3.5.2.1 One Step' RT PCR 17
2.3.5.2.2 Hot Start RT PCR 17
2.3.5.2.3 "Nested' RT PCR 17
2.3.5.2.4 Touchdown' RT PCR —,.—. 17
2.3.5.3 Pipettierschemata und Thennocyclerbedingungen für die
Amplifikation der HIV 1 po/ Abschmtte 18
2.3.5.3.1 One step' RT PCR Pipettierschema: 18
2.3.5.3.2 'One Step' RT PCR Programm im T3 Thermocycler (Biometra) 18
2.3.5.3.3 "Nested' RT PCR Pipettierschema 18
2.3.5.3.4 "Nested' RT PCR Programm im T3 Thermocycler (Biometra) 19
2.3.5.4 Kontroll PCR HIV 1 DNA 19
2.3.5.4.1 'One Step' PCR Pipettierschema: 19
2.3.5.4.2 'One Step' PCR Programm im T3 Thermocycler (Biometra) 19
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2.3.5.4.4 'Nested' PCR Programm im T3 Thermocycler (Biometra) 20
2.3.5.5 Pipettierschemata und Thennocyclerbedingungen für die
Amplifikation des integrase Abschnittes 20
2.3.5.5.1 Pipettierschema für integrase RT PCR 20
2.3.5.5.2 Programm im T3 Thermocycler (Biometra) für integrase RT PCR 20
2.3.5.5.3 Endpunktverdünnung zur Abschätzung der Sensitivität der
Intergrase RT PCR 21
2.3.6 Agarose Gelelektrophorese 21
2.3.7 Sequenzierung 22
2.3.8 Sequenzanalyse '. 23
2.3.8.1 Sequenzierung mit dem ABI PRISM™ 310 Genetic Analyser 23
2.3.8.1.1 Ansatz für HIV 1 pol Sequenzierung 24
2.3.8.1.2 Sequenzreaktion: 24
2.3.8.2 Rechnergestützte Methoden zur Sequenz Auswertung 24
2.3.8.2.1 Erstellung von Konsensussequenzen 24
3 Ergebnisse 25
3.1 Nachweis des PCR Produkts der pol Region 26
3.2 Sequenzierung und Sequenzauswertung der pol Region 28
3.3 Nachweis der viralen RNA mit der integrase PCR 30
3.3.1 Vergleich der residualen Virusreplikation mittels integrase PCR 31
4 Diskussion 34
4.1 Virusreplikation in den mononukleären Zellen des peripheren Blutes unter
einer erfolgreichen HAART 34
4.2 Nachweis des PCR Produkts derpol Region 35
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n
4.4 Nachweis der viralen RNA mit der integrase PCR 37
4.4.1 Vergleich der residualen Virusreplikation mittels integrase VCR 37
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