Bedeutung der IL-6-Signaltransduktion während der hepatischen Akutphase-Reaktion:
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2005
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| Beschreibung: | VI, 147 Bl. Ill., graph. Darst. 30 cm |
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|---|---|
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INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis IV
1 EINFÜHRUNG IN DIE PATHOPHYSIOLOGIE DER HEPATISCHEN AKUTPHASE¬
REAKTION 1
1.1 Akutphase-Reaktion (APR) 1
1.2 Die Leber als wichtige Struktur-Funktionseinheit während der hepatischen
APR und nach Leberschädigung 4
1.3 Bedeutung von Interleukin-6 während der hepatischen APR und nach
Leberschädigung 9
1.4 slgnaltransduktion durch interleukin-6 18
1.4.1 llgandenbindung und rezeptoraktivierung 19
1.4.2 derjak/stat-signalweg 20
1.4.3 Die Ras/Raf/MAPK-Kaskade 21
1.4.4 DerPhosphatidylinositol-3-Kinase-Transduktionsweg 21
1.4.5 Modifikation und Terminierung der IL-6-Signaltransduktion 21
1.5 SlGNALTRANSDUKTION DURCH TNFa UND IL-lß 26
1.6 Crosstalk der Zytokin-induzierten Signalwege 30
2 AUFGABENSTELLUNG 33
3 MATERIAL UND METHODEN 35
3.1 Chemikalien und Radiochemikalien 35
3.2 Zytokine und andere Mediatoren 35
3.3 Antikörper 35
3.4 Plasmide und cDNAs 36
3.5 Prokaryontische Zellen und deren Kultivierung 37
3.6 Herstellung kompetenter Bakterien 38
3.7 Präparation, Modifikation und Analyse von Plasmid-DNA 38
3.7.1 Transformation von Bakterien 38
3.7.2 PLASMID-PRÄPARATIONEN 39
3.7.3 Quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren 39
II
3.7.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen 39
3.7.5 Elektrophoretische Analyse von Plasmid-DNA 39
3.7.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 40
3.7.7 Auffüllen 5 -überhängender DNA-Enden 40
3.7.8 Abspaltung 5 -und 3 -Oberhängender DNA-Enden 41
3.7.9 dephosphorylierung linearisierter dna 41
3.7.10 dna-ligation 41
3.7.11 DNA-Sequenzierung 41
3.7.12 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 43
3.8 Herstellung von Oligonukleotiden 43
3.9 eukaryontische zellen und deren kultivierung 43
3.10 transiente transfektion von cos7-zellen durch elektroporation 45
3.11 Metabolische Markierung von Proteinen 45
3.11.1 [35S]-Markierung von Proteinen und Immunpräzipitation aus dem
Kulturüberstand 45
3.11.2 ,j}ulse-chase -markyerung von signalmolekülen des jak-stat-slgnalwegs 45
3.12 Tierexperimentelle Methoden 46
3.12.1 Tierzüchtung und Tierhaltung 46
3.12.2 Eingesetzte Tiermodelle der Akutphase-Reaktion 46
3.13 Proteingewinnung 47
3.13.1 Herstellung von Zell-Lys aten 47
3.13.2 Proteinbestimmung nach Bradford 48
3.14 Proteindetektion und Proteinquantifizierung 48
3.14.1 Immunpräzipitation 48
3.14.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 49
3.14.3 fluorographie 50
3.14.4 Proteintransfer auf eine VVDF-Membran („Western-Blot-semidry ) 50
3.14.5 Detektion präzipitierter Proteine mit Hilfe eines Immunblots 51
3.15 dna-bindungsstudien 51
3.15.1 Kernextraktion aus HepG2-Zellen und primären Hepatozyten 51
3.15.2 Radioaktive Markierung doppelsträngiger DNA 52
3.15.3 Elektrophoretischer-Mobilitäts-Shift-Assay(EMSA) 53
3.16 rna-isolierung und quantifizierung 54
3.16.1 rna-Isolierung aus Lebergewebe 54
3.16.2 Elektrophorese der RNA im Agarose-Formaldehyd/Formamid-Gel 54
3.16.3 Transfer der RNA auf eine Nitrozellulose-Membran (,JVorthernBloT1) 55
3.16.4 „Random Priming 56
3.16.5 Hybridisierung des Northern Blots 56
3.16.6 Semiquantitative RT-PCR Analyse 57
III
3.16.7 mrna-quantifizierung mittels echtzeit-pcr analyse 58
3.17 Statistik 59
4 ERGEBNISSE 60
4.1 Fehlen einer Typ-II-Regulation hepatischer Akutphase-Proteine bei der Maus
60
4.2 Regulation von Akutphase-Genen durch hepatocyte growth factor (HGF)-
Crosstalk mit dem Jak/STAT-Signalweg 67
4.3 lnterleukin-6-abhängige hemmung der expression hepatischer cytochrom
P450-ENZYME (CYP) 72
4.4 lnterleukin-6-abhängige hemmung der expression hepatischer organischer
anionentransporter 78
4.5 Biosynthese und Abbau der im 1L-6Signalling involvierten Proteine:-
Bedeutung für die Signaltransduktion 84
4.6 lnterleukin-6 ist essentiell für die hepatische socs3-induktion während
akuter Entzündungen 91
5 DISKUSSION 97
5.1 Regulation von Akutphase-Protein-Genen durch Interleukin-6 97
5.2 Andere Zytokine können Signalkomponenten des IL-6-Signalwegs nutzen:
Regulation von Akutphase-Protein-Genen durch hepatocyte growthfactorW3
5.3 interleukin-6-vermittelte expressionshemmung von intrazellulären
hepatischen proteinen während der akutphase-reaktion 105
5.4 Unterschiedliche Halblebenszeiten von Signalmolekülen des Interleukin-6-
induzierten jak/stat-signalwegs - bedeutung für die signalübermittlung 110
5.5 lnterleukin-6-abhängige expression von socs3 während der akutphase-
Reaktion in der Leber 114
5.6 Ausblick 117
6 ZUSAMMENFASSUNG 119
7 LITERATURVERZEICHNIS 123
8 ANHANG 146
|
| adam_txt |
I
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis IV
1 EINFÜHRUNG IN DIE PATHOPHYSIOLOGIE DER HEPATISCHEN AKUTPHASE¬
REAKTION 1
1.1 Akutphase-Reaktion (APR) 1
1.2 Die Leber als wichtige Struktur-Funktionseinheit während der hepatischen
APR und nach Leberschädigung 4
1.3 Bedeutung von Interleukin-6 während der hepatischen APR und nach
Leberschädigung 9
1.4 slgnaltransduktion durch interleukin-6 18
1.4.1 llgandenbindung und rezeptoraktivierung 19
1.4.2 derjak/stat-signalweg 20
1.4.3 Die Ras/Raf/MAPK-Kaskade 21
1.4.4 DerPhosphatidylinositol-3-Kinase-Transduktionsweg 21
1.4.5 Modifikation und Terminierung der IL-6-Signaltransduktion 21
1.5 SlGNALTRANSDUKTION DURCH TNFa UND IL-lß 26
1.6 Crosstalk der Zytokin-induzierten Signalwege 30
2 AUFGABENSTELLUNG 33
3 MATERIAL UND METHODEN 35
3.1 Chemikalien und Radiochemikalien 35
3.2 Zytokine und andere Mediatoren 35
3.3 Antikörper 35
3.4 Plasmide und cDNAs 36
3.5 Prokaryontische Zellen und deren Kultivierung 37
3.6 Herstellung kompetenter Bakterien 38
3.7 Präparation, Modifikation und Analyse von Plasmid-DNA 38
3.7.1 Transformation von Bakterien 38
3.7.2 PLASMID-PRÄPARATIONEN 39
3.7.3 Quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren 39
II
3.7.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen 39
3.7.5 Elektrophoretische Analyse von Plasmid-DNA 39
3.7.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 40
3.7.7 Auffüllen 5'-überhängender DNA-Enden 40
3.7.8 Abspaltung 5'-und 3'-Oberhängender DNA-Enden 41
3.7.9 dephosphorylierung linearisierter dna 41
3.7.10 dna-ligation 41
3.7.11 DNA-Sequenzierung 41
3.7.12 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 43
3.8 Herstellung von Oligonukleotiden 43
3.9 eukaryontische zellen und deren kultivierung 43
3.10 transiente transfektion von cos7-zellen durch elektroporation 45
3.11 Metabolische Markierung von Proteinen 45
3.11.1 [35S]-Markierung von Proteinen und Immunpräzipitation aus dem
Kulturüberstand 45
3.11.2 ,j}ulse-chase"-markyerung von signalmolekülen des jak-stat-slgnalwegs 45
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3.12.1 Tierzüchtung und Tierhaltung 46
3.12.2 Eingesetzte Tiermodelle der Akutphase-Reaktion 46
3.13 Proteingewinnung 47
3.13.1 Herstellung von Zell-Lys aten 47
3.13.2 Proteinbestimmung nach Bradford 48
3.14 Proteindetektion und Proteinquantifizierung 48
3.14.1 Immunpräzipitation 48
3.14.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 49
3.14.3 fluorographie 50
3.14.4 Proteintransfer auf eine VVDF-Membran („Western-Blot-semidry") 50
3.14.5 Detektion präzipitierter Proteine mit Hilfe eines Immunblots 51
3.15 dna-bindungsstudien 51
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3.16.1 rna-Isolierung aus Lebergewebe 54
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III
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4 ERGEBNISSE 60
4.1 Fehlen einer Typ-II-Regulation hepatischer Akutphase-Proteine bei der Maus
60
4.2 Regulation von Akutphase-Genen durch hepatocyte growth factor (HGF)-
Crosstalk mit dem Jak/STAT-Signalweg 67
4.3 lnterleukin-6-abhängige hemmung der expression hepatischer cytochrom
P450-ENZYME (CYP) 72
4.4 lnterleukin-6-abhängige hemmung der expression hepatischer organischer
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4.5 Biosynthese und Abbau der im 1L-6Signalling involvierten Proteine:-
Bedeutung für die Signaltransduktion 84
4.6 lnterleukin-6 ist essentiell für die hepatische socs3-induktion während
akuter Entzündungen 91
5 DISKUSSION 97
5.1 Regulation von Akutphase-Protein-Genen durch Interleukin-6 97
5.2 Andere Zytokine können Signalkomponenten des IL-6-Signalwegs nutzen:
Regulation von Akutphase-Protein-Genen durch hepatocyte growthfactorW3
5.3 interleukin-6-vermittelte expressionshemmung von intrazellulären
hepatischen proteinen während der akutphase-reaktion 105
5.4 Unterschiedliche Halblebenszeiten von Signalmolekülen des Interleukin-6-
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Reaktion in der Leber 114
5.6 Ausblick 117
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7 LITERATURVERZEICHNIS 123
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