Funktionelle Charakterisierung von Adenylatzyklasen der Honigbiene "Apis mellifera":
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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| Veröffentlicht: |
Jülich
Forschungszentrum, Zentralbibliothek
2005
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| Schriftenreihe: | Berichte des Forschungszentrums Jülich
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|---|---|
| adam_text | Inhalt I
I Inhalt
I INHALT I
II ABKÜRZUNGEN IV
1 EINLEITUNG 1
1.1 Strukturelle Eigenschaften membranständiger Adenylatzyklasen 2
1.2 Regulation der AC Aktivität 4
1.3 Die Bedeutung der Adenylatzyklasen für neuronale Plastizität 6
1.4 RNA lNTERFERENZ 8
1.5 Zielsetzung 9
2 MATERIAL UND METHODEN 11
2.1 Material 11
2.2 Kultivierung von Escherichia coli 11
2.2.1 Bakterienstämme und Vektoren 11
2.2.2 Zusammensetzung und Herstellung der Kulturmedien für E.coli 12
2.2.3 Zellkulturen zur Plasmidpräparation 13
2.2.4 Herstellung kompetenter Zellen 13
2.2.5 Herstellung von Mg2+ Zellen 14
2.3 DNA Präparation 14
2.3.1 plasmidpräparationen 14
2.3.2 Präparation von X Phagen DNA 15
2.4 Durchmustern von Gen Bibliotheken 15
2.4.1 Genbibliotheken 15
2.4.2 Vermehrung von X Phagen auf NZY Agar Platten (, Jlaqueassay4 ) 15
2.4.3 Filterabzüge 16
• 2.4.4 Markierung von Nukleinsäuren 16
2.4.5 Hybridisierung und Nachweisverfahren 16
2.4.6 X Phagen Isolierung 17
2.5 Reinigung und Trennung von Nukleinsäuren 18
2.5. l Phenol / chCl3 Extraktion 18
2.5.2 Ethanol Präzipitation 18
2.5.3 dna größenstandard 18
2.5.4 Gelelektrophorese 19
2.5.5 Fragment Isolierung aus agarosegelen (Heery et al. 1990) 19
2.5.6 Präparation der poly(A)+ RNA aus Honigbienengehirnen 19
2.5.7 Umschreiben von poly(A)+ RNA in Einzelstrang cDNA (RT PCR) 20
2.6 nukleinsäureanalyse 20
2.6.1 Quantifizierung 20
2.6.2 DNA Transfer („Southern Blot ) 21
2.6.3 Nichtradioaktive Sequenzierung 21
2.6.4 in snv Hybridisierung 23
Inhalt n
2.7 klonierung 23
2.7.1 Glätten überhängender Einzelstrangbereiche 23
2.7.2 Dephosphorylierung geschnittener DNA Vektoren 23
2.7.3 Phosphorylierung der 5 Enden von DNA Fragmenten 24
2.7.4 Restriktion 24
2.7.5 LlGATION 24
2.7.6 Transformation 24
2.7.7 a komplementation 25
2.8 amplif1kation von nukleinsäuren 25
2.8.1 polymerase ketten reaktion (pcr) 25
2.8.2 Rapid Amplification of cDNA Ends (5 RACE) 26
2.9 RNA lNTERFERENZ 26
2.9.1 Herstellung der GFP und Amac3 PCR Fragmente 26
2.9.2 Herstellung doppelsträngiger (ds) RNA 27
2.9.3 Injektion von dsrNA in den Ocellartrakt 28
2.9.4 Saccharose Empfindlichkeit 28
2.9.5 Präparation der RNA aus Honigbienenköpfen 29
2.9.6 Umschreiben von poly(A)+ RNA in Einzelstrang cDNA (RT PCR) 29
2.9.7 Quantifizierung der Expressionsrate des Am^c3 Gens 29
2.10 herstellung stabiler zelllinien 33
2.11 Membranproteinpräparation aus flpTM und flpAC Zellen 34
2.12 antikörper 34
2.13 immunzytochemie 35
2.14 Proteintrennung 35
2.14.1 protein größenstandard 35
2.14.2 Gelelektrophorese 36
2.14.3 „coomassie färbung von sds polyacrylamid gelen 36
2.15 Proteinanalyse 36
2.15.1 Quantifizierung 36
2.15.2 Transfer und Immobilisierung von Proteinen („Westernblot ) 37
2.15.3 Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine 38
2.15.4 TCA FÄLLUNG 38
2.16 Proteinreinigung 39
2.16.1 Anti HA Affinitätschromatographie 39
2.16.2 Calmodulin Affinitätschromatographie 39
2.17 Cyclo AMP Bestimmung 40
2.18 Calcium Fluorimetrie 40
2.19 Phylogenetische Analyse von Aminosäuresequenzen 41
3 ERGEBNISSE 4j
3.1 Identifizierung und Klonierung von ^c Genen der Honigbiene 43
3.1.1 Suche nach ac Genen in Datenbanken der Honigbiene 43
3.1.2 durchmusterung der cdna blbliothek mit dna sonden 45
¦i
l
J
Inhalt III
3.1.3 klonierung des am4c1 gens 46
3.1.4 klonierung des am4c2 gens 48
3.1.5 klonierung des am4c3 gens 51
3.1.6 Zusammenfassung der Klonierungsergebnisse 52
3.1.7 Verteilung der AmacS mRNA im Gehirn der Honigbiene 52
3.2 analyse der gene alvmcl, aml4c2 und mac3 53
3.2.1 Verwandtschaftsanalyse derProteine AmACI, AmAC2t und AmAC3 53
3.2.2 Analyse der Aminosäuresequenzen AmAC3, AmAC2t und AmAC8 55
3.3 heterologe expression der gene amac3 und amacl 60
3.3.1 klonierung der expressionsvektoren für am^c3 und amac2t 60
3.3.2 Herstellung von Zelllinien, die AmAC3 und AmAC2t konstitutiv exprimieren 63
3.3.3 Immunologischer Nachweis der Expression von AmAC3 HA und AmAC2t HA 63
3.3.4 Reinigung der Proteine AmAC3 und AmAC2t 65
3.4 funktionelle charakterisierung der proteine amac3 und amac2t 67
3.4. l Bestimmung der [cAMP], in flpaC3 und flpAC2t Zellen 68
3.4.2 Charakterisierung der AC Aktivität in flpAC3 Zellen mit Ca2+ Fluorimetrie 71
3.5 Manipulation der Aivmc3 Expression im Gehirn der Honigbiene 74
3.5.1 Saccharose Empfindlichkeit 74
3.5.2 Bestimmung der relativen Expressionrate der Amac3 mRNA 76
4 DISKUSSION 79
4.1 Eignet sich die RNAi zur Analyse von Gen Funktionen in der Honigbiene? 79
4.2 Welche Bedeutung haben cAMP Signalwege im Insektengehirn? 83
4.3 Molekulare und strukturelle Eigenschaften der Honigbienen ACs 84
4.4 Ausblick 88
5 LITERATUR 89
ANHANG 99
A.l: Translation von Nukleinsäuresequenzen 99
A.2: NUKLEINSÄURESEQUENZEN 111
A.3: Verwendete Oligonukleotide 112
|
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Inhalt I
I Inhalt
I INHALT I
II ABKÜRZUNGEN IV
1 EINLEITUNG 1
1.1 Strukturelle Eigenschaften membranständiger Adenylatzyklasen 2
1.2 Regulation der AC Aktivität 4
1.3 Die Bedeutung der Adenylatzyklasen für neuronale Plastizität 6
1.4 RNA lNTERFERENZ 8
1.5 Zielsetzung 9
2 MATERIAL UND METHODEN 11
2.1 Material 11
2.2 Kultivierung von Escherichia coli 11
2.2.1 Bakterienstämme und Vektoren 11
2.2.2 Zusammensetzung und Herstellung der Kulturmedien für E.coli 12
2.2.3 Zellkulturen zur Plasmidpräparation 13
2.2.4 Herstellung kompetenter Zellen 13
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2.4 Durchmustern von Gen Bibliotheken 15
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2.4.3 Filterabzüge 16
• 2.4.4 Markierung von Nukleinsäuren 16
2.4.5 Hybridisierung und Nachweisverfahren 16
2.4.6 X Phagen Isolierung 17
2.5 Reinigung und Trennung von Nukleinsäuren 18
2.5. l Phenol / chCl3 Extraktion 18
2.5.2 Ethanol Präzipitation 18
2.5.3 dna größenstandard 18
2.5.4 Gelelektrophorese 19
2.5.5 Fragment Isolierung aus agarosegelen (Heery et al. 1990) 19
2.5.6 Präparation der poly(A)+ RNA aus Honigbienengehirnen 19
2.5.7 Umschreiben von poly(A)+ RNA in Einzelstrang cDNA (RT PCR) 20
2.6 nukleinsäureanalyse 20
2.6.1 Quantifizierung 20
2.6.2 DNA Transfer („Southern Blot") 21
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2.7 klonierung 23
2.7.1 Glätten überhängender Einzelstrangbereiche 23
2.7.2 Dephosphorylierung geschnittener DNA Vektoren 23
2.7.3 Phosphorylierung der 5' Enden von DNA Fragmenten 24
2.7.4 Restriktion 24
2.7.5 LlGATION 24
2.7.6 Transformation 24
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2.8 amplif1kation von nukleinsäuren 25
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2.9 RNA lNTERFERENZ 26
2.9.1 Herstellung der GFP und Amac3 PCR Fragmente 26
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2.9.5 Präparation der RNA aus Honigbienenköpfen 29
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2.10 herstellung stabiler zelllinien 33
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2.19 Phylogenetische Analyse von Aminosäuresequenzen 41
3 ERGEBNISSE 4j
3.1 Identifizierung und Klonierung von ^c Genen der Honigbiene 43
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3.1.6 Zusammenfassung der Klonierungsergebnisse 52
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3.3.3 Immunologischer Nachweis der Expression von AmAC3 HA und AmAC2t HA 63
3.3.4 Reinigung der Proteine AmAC3 und AmAC2t 65
3.4 funktionelle charakterisierung der proteine amac3 und amac2t 67
3.4. l Bestimmung der [cAMP], in flpaC3 und flpAC2t Zellen 68
3.4.2 Charakterisierung der AC Aktivität in flpAC3 Zellen mit Ca2+ Fluorimetrie 71
3.5 Manipulation der Aivmc3 Expression im Gehirn der Honigbiene 74
3.5.1 Saccharose Empfindlichkeit 74
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4.1 Eignet sich die RNAi zur Analyse von Gen Funktionen in der Honigbiene? 79
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4.4 Ausblick 88
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| spelling | Wachten, Sebastian Verfasser aut Funktionelle Charakterisierung von Adenylatzyklasen der Honigbiene "Apis mellifera" Sebastian Wachten. [Forschungszentrum Jülich in der Helmholtz-Gesellschaft, Institut für Biologische Informationsverarbeitung 1] Jülich Forschungszentrum, Zentralbibliothek 2005 VII, 113 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Berichte des Forschungszentrums Jülich 4196 Zugl.: Köln, Univ., Diss., 2005 Adenylatcyclase (DE-588)4141414-7 gnd rswk-swf Biene (DE-588)4025825-7 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Biene (DE-588)4025825-7 s Adenylatcyclase (DE-588)4141414-7 s DE-188 Berichte des Forschungszentrums Jülich 4196 (DE-604)BV004194732 4196 HBZ Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=015043300&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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