Untersuchungen zur Aktivierung von EGFR-abhängigen Proteinkinasen im oralen Plattenepithelkarzinom in situ und in vitro und ihre Beziehung zur Invasions-assoziierten Änderung der Ln-5 / Gamma2 - Synthese und Deposition:
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2006
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| adam_text | Titel: Untersuchungen zur Aktivierung von EGFR-abhängigen Proteinkinasen im oralen Plattenepithelkarzinom
Autor: Richter, Petra
Jahr: 2006
Inhaltsverzeichnis
1 ZUSAMMENFASSUNG 4
2 EINLEITUNG 6
2.1 Das orale Plattenepithelkarzinom 6
2.1.1 Grundlegendes zur Tumorbiologie des oralen Plattenepithelkarzinoms 6
2.2 Signaltransduktion 8
2.2.1 Aufgaben der Signaltransduktion 8
2.2.2 Aufbau von Signaltransduktionswegen 8
2.2.2.1 Interzelluläre Kommunikationswege 8
2.2.2.2 Intrazelluläre Signaltransduktion 9
2.2.2.3 Phosphorylierung und Dephosphorylierung 9
2.3 Signaltransduktion und ECM / onkofetale Matrix 10
2.3.1 Extrazelluläre Matrix 10
2.3.2 Basalmembran 10
2.3.3 Laminin-5 11
2.3.4 Zell-Zell-Adhäsionen 12
2.3.5 Zell-Matrix-Adhäsionen 13
2.3.6 Onkofetale Matrix 14
2.4 EGFR-Signaltransduktion im OSCC 14
2.5 Kinasen der dem EGF-Rezeptor nachgeschalteten Signalwege 15
2.6 EGFR und Ln-5 im oralen Plattenepithelkarzinom 17
2.7 Zielstellung 19
3 MATERIAL UND METHODEN 21
3.1 Gewebematerial 21
3.1.1 Paraffineinbettung / konventionelle Histologie 21
3.2 Zellkulturen 22
3.2.1 Primärkultur humaner oraler Plattenepithelkarzinome 22
3.2.2 Verwendete humane Zelllinien 22
3.3 Immunhistochemischer Nachweis phosphorylierter pErk1/2, p38 MAPK
und Akt (PKB) im histologischen Präparat 23
3.3.1 Immunfärbung 23
3.3.2 Primäre Antikörper 24
3.3.3 Lichtmikroskopische Auswertung 24
3.3.4 Statistik 25
3.4 Zellkulturexperimente 26
1
Inhaltsverzeichnis
3.4.1 Stimulation von Plattenepithelkarzinomzellen mit EGF 26
3.4.1.1 Zellkulturen auf Zellkulturobjektträgern für die Lichtmikroskopie und
Fluoreszenzmikroskopie 26
3.4.1.2 Zellkulturen für PCR und Westernblot 26
3.4.1.3 Inhibitionsexperimente 27
3.4.2 Immunfluoreszenzmarkierungen 27
3.4.2.1 Immunfluoreszenzeinfachmarkierungen für pErk1/2 und pAkt 27
3.4.2.2 Immunfluoreszenzdoppelmarkierungen für pErk1/2 und Integrine 27
3.4.2.3 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 28
3.4.3 Westernblot 29
3.4.3.1 Nachweis von pErk1/2, pAkt und Tyrosinkinase-Aktivität 29
3.4.3.2 Nachweis der Ln-5 / y 2-Kette 30
3.4.4 RT-PCR 31
3.4.4.1 Extraktion der gesamt-RNA 31
3.4.4.2 RT-PCR 32
3.4.4.3 Agarose-Gel-Elektrophorese 34
3.4.4.4 Semiquantitative Auswertung 34
3.5 Verzeichnis der Puffer-, Färb- und Fixierlösungen 35
3.5.1 Konventionelle Histologie 35
3.5.2 Pufferund Lösungen für die Zellkulturen 36
3.5.3 Pufferund Lösungen für das DAKO ChemMate™Detektionskit 36
3.5.4 Puffer und Gele für die Proteinextraktion und den Westernblot 37
3.5.5 Gele und Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese 41
3.5.6 Wachstumsfaktoren zur Stimulation 41
3.5.7 Inhibitoren 41
4 ERGEBNISSE 42
4.1 Immunhistochemie 42
4.1.1 Phosphorylierte Erk1/2, p38 MAPK und Akt in normaler
Mundschleimhaut 42
4.1.2 Phosphorylierte Erk1/2, Akt und p38 MAPK in hyperplastischer und
dysplastischer Mundschleimhaut 43
4.1.3 Phosphorylierte Erk1/2, Akt und p38 MAPK im OSCC unterschiedlicher
Differenzierungs-und Reifegrade 44
4.1.4 Die Relation von zytoplasmatischem Ln-5 / y2 und Phosphorylierung
derKinasen 48
4.2 Zellkulturexperimente 51
2
Inhaltsverzeichnis
4.2.1 Die Stimulation von Zellen der OSCC-Zellinie PE/CA-PJ15 mit EGF
führt zu einer Zunahme der Tyrosinkinase-Aktivität und von
phosphorylierter Erk1/2 (p44/42 MAPK), nicht aber von phosphorylierter
Akt-Kinase 51
4.2.2 Die Stimulation von Zellen der OSCC-Zellinie PE/CA-PJ15 mit EGF
führt zu Änderungen im Wachstumsverhalten und zur Reorganisation
der Integrin-ß4 Kette 53
4.2.3 Die Stimulation von Zellen der OSCC-Zellinie PE/CA-PJ15 mit EGF
führt zu einer gesteigerten Synthese der Ln-5 / y2-Kette 55
4.2.4 Die gesteigerte Synthese der Ln-5 / y2-Kette nach Stimulation von
Zellen der OSCC-Zellinie PE/CA-PJ15 mit EGF ist mit Inhibitoren der
Kinasen MEK und Pl(3)-K nicht beeinflussbar 58
5 DISKUSSION 60
5.1 Immunhistochemie 60
5.1.1 Die Menge der detektierbaren phosphorylierten Kinasen ist abhängig
von Asservierung, Fixation und Vorbehandlung der Gewebe 60
5.1.2 pErk1/2 und pAkt reflektieren die Biologie des sich regenerierenden
Epithels der normalen Mukosa 60
5.1.3 Nur die zytoplasmatische Akkumulation von pAkt zeigt eine Korrelation
zum Malignitätsgrad im OSCC 61
5.1.4 Invasionsbedingte Veränderungen in der Ln-5 / y2-Ketten-Deposition
(zytoplasmatische Akkumulation) zeigen keine räumliche Assoziation
zur Aktivierung von Erk1/2, p38 MAPK und Akt 63
5.2 Zellkulturexperimente 63
5.2.1 EGF-Stimulation der Zelllinie PE/CA-PJ15 führt zu einer Aktivierung von
ERK1/2 aber nicht von Akt 63
5.2.2 EGF-Stimulation führt zu einem Adhäsionsverlust von OSCC-Zellen in
vitro und zu einer Reorganisation von Ln-5 66
5.2.3 EGF-Stimulation führt zu einer Reorganisation von Integrinen 67
5.2.4 EGF-Stimulation führt zu einer gesteigerten Ln-5-Synthese in OSCC-
Zellen in vitro 69
5.2.5 Die EGF-induzierte Ln-5 Synthese in OSCC-Zellen ist ein multifaktoriell
reguliertes Phänomen 70
6 SCHLUSSFOLGERUNGEN 73
7 LITERATURVERZEICHNIS 75
3
|
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Titel: Untersuchungen zur Aktivierung von EGFR-abhängigen Proteinkinasen im oralen Plattenepithelkarzinom
Autor: Richter, Petra
Jahr: 2006
Inhaltsverzeichnis
1 ZUSAMMENFASSUNG 4
2 EINLEITUNG 6
2.1 Das orale Plattenepithelkarzinom 6
2.1.1 Grundlegendes zur Tumorbiologie des oralen Plattenepithelkarzinoms 6
2.2 Signaltransduktion 8
2.2.1 Aufgaben der Signaltransduktion 8
2.2.2 Aufbau von Signaltransduktionswegen 8
2.2.2.1 Interzelluläre Kommunikationswege 8
2.2.2.2 Intrazelluläre Signaltransduktion 9
2.2.2.3 Phosphorylierung und Dephosphorylierung 9
2.3 Signaltransduktion und ECM / onkofetale Matrix 10
2.3.1 Extrazelluläre Matrix 10
2.3.2 Basalmembran 10
2.3.3 Laminin-5 11
2.3.4 Zell-Zell-Adhäsionen 12
2.3.5 Zell-Matrix-Adhäsionen 13
2.3.6 Onkofetale Matrix 14
2.4 EGFR-Signaltransduktion im OSCC 14
2.5 Kinasen der dem EGF-Rezeptor nachgeschalteten Signalwege 15
2.6 EGFR und Ln-5 im oralen Plattenepithelkarzinom 17
2.7 Zielstellung 19
3 MATERIAL UND METHODEN 21
3.1 Gewebematerial 21
3.1.1 Paraffineinbettung / konventionelle Histologie 21
3.2 Zellkulturen 22
3.2.1 Primärkultur humaner oraler Plattenepithelkarzinome 22
3.2.2 Verwendete humane Zelllinien 22
3.3 Immunhistochemischer Nachweis phosphorylierter pErk1/2, p38 MAPK
und Akt (PKB) im histologischen Präparat 23
3.3.1 Immunfärbung 23
3.3.2 Primäre Antikörper 24
3.3.3 Lichtmikroskopische Auswertung 24
3.3.4 Statistik 25
3.4 Zellkulturexperimente 26
1
Inhaltsverzeichnis
3.4.1 Stimulation von Plattenepithelkarzinomzellen mit EGF 26
3.4.1.1 Zellkulturen auf Zellkulturobjektträgern für die Lichtmikroskopie und
Fluoreszenzmikroskopie 26
3.4.1.2 Zellkulturen für PCR und Westernblot 26
3.4.1.3 Inhibitionsexperimente 27
3.4.2 Immunfluoreszenzmarkierungen 27
3.4.2.1 Immunfluoreszenzeinfachmarkierungen für pErk1/2 und pAkt 27
3.4.2.2 Immunfluoreszenzdoppelmarkierungen für pErk1/2 und Integrine 27
3.4.2.3 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 28
3.4.3 Westernblot 29
3.4.3.1 Nachweis von pErk1/2, pAkt und Tyrosinkinase-Aktivität 29
3.4.3.2 Nachweis der Ln-5 / y 2-Kette 30
3.4.4 RT-PCR 31
3.4.4.1 Extraktion der gesamt-RNA 31
3.4.4.2 RT-PCR 32
3.4.4.3 Agarose-Gel-Elektrophorese 34
3.4.4.4 Semiquantitative Auswertung 34
3.5 Verzeichnis der Puffer-, Färb- und Fixierlösungen 35
3.5.1 Konventionelle Histologie 35
3.5.2 Pufferund Lösungen für die Zellkulturen 36
3.5.3 Pufferund Lösungen für das DAKO ChemMate™Detektionskit 36
3.5.4 Puffer und Gele für die Proteinextraktion und den Westernblot 37
3.5.5 Gele und Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese 41
3.5.6 Wachstumsfaktoren zur Stimulation 41
3.5.7 Inhibitoren 41
4 ERGEBNISSE 42
4.1 Immunhistochemie 42
4.1.1 Phosphorylierte Erk1/2, p38 MAPK und Akt in normaler
Mundschleimhaut 42
4.1.2 Phosphorylierte Erk1/2, Akt und p38 MAPK in hyperplastischer und
dysplastischer Mundschleimhaut 43
4.1.3 Phosphorylierte Erk1/2, Akt und p38 MAPK im OSCC unterschiedlicher
Differenzierungs-und Reifegrade 44
4.1.4 Die Relation von zytoplasmatischem Ln-5 / y2 und Phosphorylierung
derKinasen 48
4.2 Zellkulturexperimente 51
2
Inhaltsverzeichnis
4.2.1 Die Stimulation von Zellen der OSCC-Zellinie PE/CA-PJ15 mit EGF
führt zu einer Zunahme der Tyrosinkinase-Aktivität und von
phosphorylierter Erk1/2 (p44/42 MAPK), nicht aber von phosphorylierter
Akt-Kinase 51
4.2.2 Die Stimulation von Zellen der OSCC-Zellinie PE/CA-PJ15 mit EGF
führt zu Änderungen im Wachstumsverhalten und zur Reorganisation
der Integrin-ß4 Kette 53
4.2.3 Die Stimulation von Zellen der OSCC-Zellinie PE/CA-PJ15 mit EGF
führt zu einer gesteigerten Synthese der Ln-5 / y2-Kette 55
4.2.4 Die gesteigerte Synthese der Ln-5 / y2-Kette nach Stimulation von
Zellen der OSCC-Zellinie PE/CA-PJ15 mit EGF ist mit Inhibitoren der
Kinasen MEK und Pl(3)-K nicht beeinflussbar 58
5 DISKUSSION 60
5.1 Immunhistochemie 60
5.1.1 Die Menge der detektierbaren phosphorylierten Kinasen ist abhängig
von Asservierung, Fixation und Vorbehandlung der Gewebe 60
5.1.2 pErk1/2 und pAkt reflektieren die Biologie des sich regenerierenden
Epithels der normalen Mukosa 60
5.1.3 Nur die zytoplasmatische Akkumulation von pAkt zeigt eine Korrelation
zum Malignitätsgrad im OSCC 61
5.1.4 Invasionsbedingte Veränderungen in der Ln-5 / y2-Ketten-Deposition
(zytoplasmatische Akkumulation) zeigen keine räumliche Assoziation
zur Aktivierung von Erk1/2, p38 MAPK und Akt 63
5.2 Zellkulturexperimente 63
5.2.1 EGF-Stimulation der Zelllinie PE/CA-PJ15 führt zu einer Aktivierung von
ERK1/2 aber nicht von Akt 63
5.2.2 EGF-Stimulation führt zu einem Adhäsionsverlust von OSCC-Zellen in
vitro und zu einer Reorganisation von Ln-5 66
5.2.3 EGF-Stimulation führt zu einer Reorganisation von Integrinen 67
5.2.4 EGF-Stimulation führt zu einer gesteigerten Ln-5-Synthese in OSCC-
Zellen in vitro 69
5.2.5 Die EGF-induzierte Ln-5 Synthese in OSCC-Zellen ist ein multifaktoriell
reguliertes Phänomen 70
6 SCHLUSSFOLGERUNGEN 73
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