Strahlenbiologische Charakterisierung einer murinen Osteozytenzelllinie:
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2006
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|---|---|
| adam_text | 1 Einleitung 7
1.1 Osteoporose 8
1.2 Makroskopische Aspekte des Knochens 10
1.3 Mikroskopische Aspekte des Knochens 11
1.3.1 Osteoblasten 11
1.3.2 Osteozyten 12
1.3.3 Osteoklasten 12
1.3.4 Remodeling durch die multizelluläre Umbaueinheit 12
1.4 Regulationsmechanismen des Knochenstoffwechsels 13
1.5 Charakteristische Knochenmarker für das Knochenremodeling 19
1.6 Charakterisierung der Knochenzelldifferenzierungsstufe durch
Knochenzellmarker 20
1.7 Strahlung und zelluläre Signaltransduktion 22
1.7.1 Wirkung auf den Gesamtorganismus 24
1.7.2 Wirkung auf zellulärer Ebene 24
1.7.2.1 Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen 26
1.7.2.2 Signaltransduktion nach DNA Schaden 29
1.7.3 NF Kß Signaltransduktionsweg 33
1.7.3.1 Tumor Nekrose Faktor Rezeptor (TNFR) vennittelte Aktivierung des NF kB
Signalwegs 36
1.8 Visualisierung und Messung von Genaktivierungen 39
1.9 Knochenzelllinien 41
1.10 Fragestellung 42
2 Material und Methoden 44
2.1 Zellkultur 44
2.1.1 Verwendete Zelllinien 44
2.1.2 Materialien 44
2.1.2.1 Plastikmaterialien in der Zellkultur 44
2.1.2.2 Glasmaterialien in der Zellkultur 45
2.1.2.3 Chemikalien 45
2.1.2.4 Gebrauchslösungen 45
2.1.2.5 Zellkulturmedien 46
2.1.2.6 Antibiotika 48
3
2.1.2.7 Serum 48
2.1.3 Kulturbedingungen 50
2.1.3.1 Arbeitsbank 50
2.1.3.2 Wasserbad 50
2.1.3.3 Kulturschrank 50
2.1.4 Kollagen Beschichtung 50
2.1.5 Kultivieren und Subkultivieren 51
2.1.6 Wachstumskinetik während einer Passage 51
2.1.7 Gefrierkonservieren und Auftauen von Zellen 52
2.1.8 Nachweis von Mycoplasmenbefall in der Zellkultur 53
2.1.8.1 Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis von Mycoplasmen mit 4 ,6 Diamidino
2 Phenylindoldihydrochlorid(DAPI) 53
2.1.8.2 Nachweis einer Mycoplasmen Kontamination über eine „Polymerase chain
reaction (PCR) 54
2.1.9 Eliminierung der Mycoplasmen mit BM Cyclin 57
2.2 Charakterisierung der Knochenzelllinien 58
2.2.1 Phasenkontrastmikroskopische Dokumentation der Zelllinien 58
2.2.2 Bestimmung der alkalischen Phosphatase (AP) Aktivität 58
2.2.2.1 In situ Nachweis der AP Aktivität mit Nitro Blau Tetrazolin (NBT) und 5 Bromo
4 Chloro 3 lndolyl Phosphat(BCIP) 58
2.2.2.2 Messung der Enzymaktivität in Zelllysaten mit Hilfe von p Nitrophenol 59
2.2.3 Nachweis der mRNA für Osteocalcin und E11 61
2.2.3.1 RNA Isolierung 61
2.2.3.2 RT PCR für Osteocalcin 62
2.2.3.3 RT PCR für E11 65
2.3 Strahlenbiologische Experimente 65
2.3.1 Exposition mit Röntgenstrahlung 65
2.3.2 Koloniebildungstest 66
2.3.2.1 Dosis Effekt Beziehung 67
2.3.2.2 Berechnung der Dosis Effekt Kurven und Auswertung 69
2.4 Gentechnische Methoden in der Zellkultur 72
2.4.1 Verwendete Plasmide 72
2.4.2 Stabile Transfektion 74
2.4.3 MTT Test 75
2.4.4 Nachweis der EGFP Expression nach Behandlung mit TNF a 75
4
2.4.4.1 FACS Analyse 76
2.4.5 Nachweis der EGFP Expression nach Röntgen Bestrahlung 78
3 Ergebnisse 79
3.1 Zellbiologische Ergebnisse 79
3.1.1 Morphologie der Zellen in Kultur 79
3.1.2 Wachstumsverhalten und Wachstumskinetik 80
3.1.2.1 Wachstumsverhalten 80
3.1.2.2 Wachstumskinetik der Zelllinien MLO Y4, OCT 1 und AA8 80
3.1.2.3 Wachstumskinetik der Zelllinien bei unterschiedlichen Serumkonzentrationen
82
3.2 Biochemische Charakterisierung 86
3.2.1 In situ Nachweis der AP Aktivität 86
3.2.2 Messung der AP Aktivität in Zelllysaten 87
3.2.3 Nachweis der mRNA von OC und E11 89
3.2.3.1 Osteocalcin 90
3.2.3.2 E11 90
3.3 Strahlenbiologische Charakterisierung von MLO Y4 92
3.4 Stabile Transfektion der Osteozytenzelllinie MLO Y4 93
3.4.1 Bestimmung der letalen Geniticindosis 94
3.4.2 Selektion der transfizierten Klone 95
3.4.3 Exposition der Klone mit Röntgenstrahlung 99
4 Diskussion 103
4.1 Zellbiologische Charakterisierung 103
4.2 Biochemische Charakterisierung 105
4.3 Strahlenbiologische Charakterisierung 108
4.4 Induzierbare NF icB abhängige Genexpression in MLO Y4 111
4.5 Ausblick 114
5 Zusammenfassung 116
6 Literaturverzeichnis 118
7 Abkürzungsverzeichnis 126
8 Eigene Publikationen und Kongressbeiträge 131
9 Danksagung 132
10 Lebenslauf 133
5
|
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1 Einleitung 7
1.1 Osteoporose 8
1.2 Makroskopische Aspekte des Knochens 10
1.3 Mikroskopische Aspekte des Knochens 11
1.3.1 Osteoblasten 11
1.3.2 Osteozyten 12
1.3.3 Osteoklasten 12
1.3.4 Remodeling durch die multizelluläre Umbaueinheit 12
1.4 Regulationsmechanismen des Knochenstoffwechsels 13
1.5 Charakteristische Knochenmarker für das Knochenremodeling 19
1.6 Charakterisierung der Knochenzelldifferenzierungsstufe durch
Knochenzellmarker 20
1.7 Strahlung und zelluläre Signaltransduktion 22
1.7.1 Wirkung auf den Gesamtorganismus 24
1.7.2 Wirkung auf zellulärer Ebene 24
1.7.2.1 Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen 26
1.7.2.2 Signaltransduktion nach DNA Schaden 29
1.7.3 NF Kß Signaltransduktionsweg 33
1.7.3.1 Tumor Nekrose Faktor Rezeptor (TNFR) vennittelte Aktivierung des NF kB
Signalwegs 36
1.8 Visualisierung und Messung von Genaktivierungen 39
1.9 Knochenzelllinien 41
1.10 Fragestellung 42
2 Material und Methoden 44
2.1 Zellkultur 44
2.1.1 Verwendete Zelllinien 44
2.1.2 Materialien 44
2.1.2.1 Plastikmaterialien in der Zellkultur 44
2.1.2.2 Glasmaterialien in der Zellkultur 45
2.1.2.3 Chemikalien 45
2.1.2.4 Gebrauchslösungen 45
2.1.2.5 Zellkulturmedien 46
2.1.2.6 Antibiotika 48
3
2.1.2.7 Serum 48
2.1.3 Kulturbedingungen 50
2.1.3.1 Arbeitsbank 50
2.1.3.2 Wasserbad 50
2.1.3.3 Kulturschrank 50
2.1.4 Kollagen Beschichtung 50
2.1.5 Kultivieren und Subkultivieren 51
2.1.6 Wachstumskinetik während einer Passage 51
2.1.7 Gefrierkonservieren und Auftauen von Zellen 52
2.1.8 Nachweis von Mycoplasmenbefall in der Zellkultur 53
2.1.8.1 Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis von Mycoplasmen mit 4',6 Diamidino
2 Phenylindoldihydrochlorid(DAPI) 53
2.1.8.2 Nachweis einer Mycoplasmen Kontamination über eine „Polymerase chain
reaction" (PCR) 54
2.1.9 Eliminierung der Mycoplasmen mit BM Cyclin 57
2.2 Charakterisierung der Knochenzelllinien 58
2.2.1 Phasenkontrastmikroskopische Dokumentation der Zelllinien 58
2.2.2 Bestimmung der alkalischen Phosphatase (AP) Aktivität 58
2.2.2.1 In situ Nachweis der AP Aktivität mit Nitro Blau Tetrazolin (NBT) und 5 Bromo
4 Chloro 3 lndolyl Phosphat(BCIP) 58
2.2.2.2 Messung der Enzymaktivität in Zelllysaten mit Hilfe von p Nitrophenol 59
2.2.3 Nachweis der mRNA für Osteocalcin und E11 61
2.2.3.1 RNA Isolierung 61
2.2.3.2 RT PCR für Osteocalcin 62
2.2.3.3 RT PCR für E11 65
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2.3.1 Exposition mit Röntgenstrahlung 65
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2.3.2.1 Dosis Effekt Beziehung 67
2.3.2.2 Berechnung der Dosis Effekt Kurven und Auswertung 69
2.4 Gentechnische Methoden in der Zellkultur 72
2.4.1 Verwendete Plasmide 72
2.4.2 Stabile Transfektion 74
2.4.3 MTT Test 75
2.4.4 Nachweis der EGFP Expression nach Behandlung mit TNF a 75
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2.4.5 Nachweis der EGFP Expression nach Röntgen Bestrahlung 78
3 Ergebnisse 79
3.1 Zellbiologische Ergebnisse 79
3.1.1 Morphologie der Zellen in Kultur 79
3.1.2 Wachstumsverhalten und Wachstumskinetik 80
3.1.2.1 Wachstumsverhalten 80
3.1.2.2 Wachstumskinetik der Zelllinien MLO Y4, OCT 1 und AA8 80
3.1.2.3 Wachstumskinetik der Zelllinien bei unterschiedlichen Serumkonzentrationen
82
3.2 Biochemische Charakterisierung 86
3.2.1 In situ Nachweis der AP Aktivität 86
3.2.2 Messung der AP Aktivität in Zelllysaten 87
3.2.3 Nachweis der mRNA von OC und E11 89
3.2.3.1 Osteocalcin 90
3.2.3.2 E11 90
3.3 Strahlenbiologische Charakterisierung von MLO Y4 92
3.4 Stabile Transfektion der Osteozytenzelllinie MLO Y4 93
3.4.1 Bestimmung der letalen Geniticindosis 94
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3.4.3 Exposition der Klone mit Röntgenstrahlung 99
4 Diskussion 103
4.1 Zellbiologische Charakterisierung 103
4.2 Biochemische Charakterisierung 105
4.3 Strahlenbiologische Charakterisierung 108
4.4 Induzierbare NF icB abhängige Genexpression in MLO Y4 111
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10 Lebenslauf 133
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