In-vitro-Modifikationen von Rho-GTPasen: Untersuchungen zu den carboxyterminalen Voraussetzungen für Rho-GTPase-Effektor-Interaktionen am Beispiel der Phospholipase C
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2005
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| Beschreibung: | Ulm, Univ., Diss., 2006 |
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen
1 Einleitung 1
1.1 Signaltransduktion 1
1.2Rho GTPasen 3
1.3 Prenyltransferasen 6
1.4 Endoproteolyse von CAAX Proteinen 9
1.5 Carboxymethylierung 10
1.6 Phospholipasen 11
1.7 Ziele der Arbeit 14
2 Material 15
2.1 Chemikalien 15
2.2 Radioaktiv markierte Chemikalien 17
2.3 Enzyme und Kits 17
2.4 Verbrauchsmaterial 17
2.5 Säulen und Gele für die Chromatographie 18
2.6 Pro und eukaryontische Zellstämme 18
2.7 Plasmide 18
2.8 Primer zur DNA Sequenzierung und für die PCR 18
2.9 Rekombinante Baculoviren 19
2.10 Molekulargewichtsmarker für die SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese
(SDS PAGE) 19
2.11 Antikörper 20
2.12 Geräte 20
2.13 Software 21
3 Methoden 22
3.1 Mikrobiologische Methoden 22
3.2 Molekularbiologische Methoden 24
3.3 Proteinexpression in Bakterien 32
3.4 Eukaryontische Zellkultur 34
3.5 Proteinexpression in Insektenzellen 35
3.6 Proteinbiochemie 38
3.7 Chromatographische Methoden 44
INHALTSVERZEICHNIS
3.8 Bestimmung der GTP[S] Bindungsstellen 46
3.9 In vitro Modifikationen 48
3.10 Nachweis der Carboxymethylierung 49
3.11 Bestimmung der Phospholipase C Aktivität 50
4 Ergebnisse 52
4.1 Klonierung der cDNAs der Rac2 Mutanten 52
4.2 Ligation der cDNAs der Rac2 Mutanten in pCR 2.1 und pVL1393 Vektoren 53
4.3 Ligation der cDNAs der Rac2 Mutanten in pGEX 2TK Vektoren 54
4.4 Ligation der AhRcel cDNA in pCR 2.1 und pVL 1393 Vektoren 54
4.5 Proteinexpression der Rac2 Mutanten Rac2L192M, Rac2L192S, Rac2L192C und Rac2L192Q
in S/9 Insektenzellen 56
4.6 Reinigung der GST Fusionsproteine 58
4.7 Reinigung der rFTase 60
4.8 Stimulation der PLCp^A durch in S/9 Insektenzellen exprimierte Rac2 Mutanten .. 63
4.9 Stimulation der PLCß2A durch GST Rac2 Mutanten 65
4.10 Einfluss der Bedingungen der/« v/Yro Isoprenylierung auf die PLCp2A
Stimulation 67
4.11 Stimulation der PLCß2A durch GST Rac2WT und GST Rac2L192M in Abhängigkeit
von der Temperatur während der Vorinkubation und von der Natriumcholat
Konzentration 70
4.12 Stimulation der PLCß2A durch GST Rac2WT und GST RacL192M in Abhängigkeit
von der Zinkchlorid Konzentration 72
4.13 Stimulation der PLCß2A durch geranylgeranyliertes GST Rac2WT und
farnesyliertes GST Rac2L192M 74
4.14 Einfluss der Endoproteolyse von GST Rac2WT und GST Rac2L192M durch AhRcel
aufdiePLCß2A Stimulation 75
4.15 Einfluss der Carboxymethylierung von GST Rac2WT und GST Rac2L192M durch
die lernt auf die PLCß2A Stimulation 778
5 Diskussion 81
6 Zusammenfassung 100
7 Literaturverzeichnis 102
8 Danksagung 120
9 Lebenslauf 122
|
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INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen
1 Einleitung 1
1.1 Signaltransduktion 1
1.2Rho GTPasen 3
1.3 Prenyltransferasen 6
1.4 Endoproteolyse von CAAX Proteinen 9
1.5 Carboxymethylierung 10
1.6 Phospholipasen 11
1.7 Ziele der Arbeit 14
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2.2 Radioaktiv markierte Chemikalien 17
2.3 Enzyme und Kits 17
2.4 Verbrauchsmaterial 17
2.5 Säulen und Gele für die Chromatographie 18
2.6 Pro und eukaryontische Zellstämme 18
2.7 Plasmide 18
2.8 Primer zur DNA Sequenzierung und für die PCR 18
2.9 Rekombinante Baculoviren 19
2.10 Molekulargewichtsmarker für die SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese
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3 Methoden 22
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3.2 Molekularbiologische Methoden 24
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3.4 Eukaryontische Zellkultur 34
3.5 Proteinexpression in Insektenzellen 35
3.6 Proteinbiochemie 38
3.7 Chromatographische Methoden 44
INHALTSVERZEICHNIS
3.8 Bestimmung der GTP[S] Bindungsstellen 46
3.9 In vitro Modifikationen 48
3.10 Nachweis der Carboxymethylierung 49
3.11 Bestimmung der Phospholipase C Aktivität 50
4 Ergebnisse 52
4.1 Klonierung der cDNAs der Rac2 Mutanten 52
4.2 Ligation der cDNAs der Rac2 Mutanten in pCR 2.1 und pVL1393 Vektoren 53
4.3 Ligation der cDNAs der Rac2 Mutanten in pGEX 2TK Vektoren 54
4.4 Ligation der AhRcel cDNA in pCR 2.1 und pVL 1393 Vektoren 54
4.5 Proteinexpression der Rac2 Mutanten Rac2L192M, Rac2L192S, Rac2L192C und Rac2L192Q
in S/9 Insektenzellen 56
4.6 Reinigung der GST Fusionsproteine 58
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4.8 Stimulation der PLCp^A durch in S/9 Insektenzellen exprimierte Rac2 Mutanten . 63
4.9 Stimulation der PLCß2A durch GST Rac2 Mutanten 65
4.10 Einfluss der Bedingungen der/« v/Yro Isoprenylierung auf die PLCp2A
Stimulation 67
4.11 Stimulation der PLCß2A durch GST Rac2WT und GST Rac2L192M in Abhängigkeit
von der Temperatur während der Vorinkubation und von der Natriumcholat
Konzentration 70
4.12 Stimulation der PLCß2A durch GST Rac2WT und GST RacL192M in Abhängigkeit
von der Zinkchlorid Konzentration 72
4.13 Stimulation der PLCß2A durch geranylgeranyliertes GST Rac2WT und
farnesyliertes GST Rac2L192M 74
4.14 Einfluss der Endoproteolyse von GST Rac2WT und GST Rac2L192M durch AhRcel
aufdiePLCß2A Stimulation 75
4.15 Einfluss der Carboxymethylierung von GST Rac2WT und GST Rac2L192M durch
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