Untersuchung zur Optimierung lentiviraler Vektoren durch Variationen des VSV-G Hüllproteins:
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| adam_text | Titel: Untersuchung zur Optimierung lentiviraler Vektoren durch Variationen des VSV-G-Hüllproteins
Autor: Köstler, Judith Maria
Jahr: 2006
Inhaltsverzeichnis
A. Einleitung 1
A.1. Entwicklung der Gentherapie 1
A.2. Einsatzbereiche der Gentherapie 2
A.2.1. Behandlung von Erbkrankheiten 3
A.2.2. Behandlung von Malignomen 4
A.2.3. Behandlung von Infektionskrankheiten 5
A3. Vektoren zur Genübertragung 5
A.4. Virale Gentherapie-Vektoren 7
A.5. Retrovirale Vektoren 9
A.5.1. Grundlagen der Retroviren-Biologie 10
A.5.2. Klassische retrovirale Vektorsysteme 11
A.5.3. Lentivirale Vektoren 13
A.5.4. Pseudotypisierte lentivirale Vektoren 16
A.5.5. Zielsetzung der Arbeit 17
B. Material und Methoden 18
B.I.Material 18
B. 1.1. Bakterien 18
B. 1.2. Nährmedien für Bakterien 18
B.1.2.1. Flüssigmedien 18
B. 1.2.2. Nährböden 19
B.1.3. Eukaryontische Zellinien und Nährmedien 19
B. 1.4. Nukleinsäuren 19
B.1.4.1. Plasmidvektoren (siehe Anhang F.3.) 19
B.1.4.2. Oligonukleotide 20
B.2. Methoden 20
B.2.1. Herstellung synthetischer Gene 20
B.2.1.1. Entwurf der kodonoptimierten Gene 20
B.2.1.2. Aufbau eines synthetischen Gens 22
B.2.2. Molekularbiologische DNA-Präparations- und Klonierungsverfahren28
B.2.2.1. Enzymatische Spaltung von Nukleinsäuren 28
B.2.2.2. Agarose-Gelelektrophorese 28
B.2.2.3. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose 29
B.2.2.4. Ligation von DNA-Fragmenten 29
B.2.2.5. Herstellung transformationskompetenter Bakterien 29
B.2.2.6. Transformation von Plasmiden in E. coli 29
B.2.2.7. Präparation und Reinigung von Plasmid-DNA aus E. coli 30
B.2.2.8 PCR (polymerase chain reaction) 30
B.2.2.9. DNA-Sequenzierung 31
B.2.2.10. DNA-Sequenzierauswertung 33
B.2.3. Transfektion 34
B.2.3.1. Transfektion von adhärenten Zellen durch CaHPCVPräzipitation 34
B.2.3.2. Ernte und Aufarbeitung der Zellen und Zellkulturüberstände nach
Transfektion 34
B.2.4. Analyse von Proteinen 35
B.2.4.1. Quantitative Proteinbestimmung (BIORAD) 35
B.2.4.2. Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamid-
Gelelekrophorese 36
B.2.4.3. Detektion spezifischer Proteine mit Hilfe monoklonaler Antikörper37
B.2.4.3.1. Proteintransfer auf Nitrocellulose: Westem-Blot-Analyse 37
B.2.4.3.2. Detektion über eine Enzym/Substrat-vermittelte Farbreaktion 37
B.2.4.3.3. Detektion des VSV-G mittels monoklonalem Antikörper in der
FACS-Analyse 38
B.2.4.3.4 Antikörper 38
B.2.4.3.5 Proteinstandards 39
C. Ergebnisse 40
C.1. Voraussetzungen für eine sichere und effiziente Transduktion 40
C.2. pHIT/G als Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen 41
C.3. Herstellung des VSV G-Konstruktes auf der Basis des synthetischen
Leserahmens 41
C.4. Vergleich der Expressions- und Transduktionsergebnisse 43
C.4.1. Einfluss der RNA- und Codonoptimierung innerhalb der
kodierenden Sequenz auf die Expression des VSV-G Proteins 43
C.4.2. Einfluss heterologer 5- Signalpeptide auf die Expression und
Oberflächenexpression des VSV-G Proteins 45
C.4.3. Einfluss der verschiedenen Vektoren auf die Expression des
synthetisch hergestellten, kodonoptimierten VSV-G 49
C.4.4. Einfluss der verschiedenen Vektoren auf die Expression des
Wildtyp-VSV-G ohne den 3- untranslatierten Bereich 51
C.4.5. Einfluss der 3 - untranslatierten Region auf die Expression von
VSV-G in Abhängigkeit von Wildtyp- und synthetisch
hergestelltem, codonoptimiertem VSV-G 54
D. Diskussion 57
D.1. Anforderungen an Gentherapievektoren 57
D.2. Veränderte AS-Sequenz 58
D.3. Verschiedene Signalsequenzen 60
D.4. Nichtkodierende Sequenzen 61
D.5. Zytotoxizität 62
D.6. Ausblicke 63
D.6.1. Induzierbare Systeme 63
D.6.2. Weiterentwicklung der Gentherapievektoren 64
D.7. Rückschläge und Hoffnungen 65
E. Zusammenfassung 66
F. Anhang 68
F. 1. Oligonukleotide für die Herstellung synthetischer Gene 68
F.2. Codonoptimierte Sequenz im Vergleich zur Wildtypsequenz 72
F.3. Verwendete Klonierungs- und Expressionsvektoren 75
F.4. Abkürzungen 76
G. Literaturverzeichnis 80
H. Danksagung 89
I. Lebenslauf 90
|
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Titel: Untersuchung zur Optimierung lentiviraler Vektoren durch Variationen des VSV-G-Hüllproteins
Autor: Köstler, Judith Maria
Jahr: 2006
Inhaltsverzeichnis
A. Einleitung 1
A.1. Entwicklung der Gentherapie 1
A.2. Einsatzbereiche der Gentherapie 2
A.2.1. Behandlung von Erbkrankheiten 3
A.2.2. Behandlung von Malignomen 4
A.2.3. Behandlung von Infektionskrankheiten 5
A3. Vektoren zur Genübertragung 5
A.4. Virale Gentherapie-Vektoren 7
A.5. Retrovirale Vektoren 9
A.5.1. Grundlagen der Retroviren-Biologie 10
A.5.2. Klassische retrovirale Vektorsysteme 11
A.5.3. Lentivirale Vektoren 13
A.5.4. Pseudotypisierte lentivirale Vektoren 16
A.5.5. Zielsetzung der Arbeit 17
B. Material und Methoden 18
B.I.Material 18
B. 1.1. Bakterien 18
B. 1.2. Nährmedien für Bakterien 18
B.1.2.1. Flüssigmedien 18
B. 1.2.2. Nährböden 19
B.1.3. Eukaryontische Zellinien und Nährmedien 19
B. 1.4. Nukleinsäuren 19
B.1.4.1. Plasmidvektoren (siehe Anhang F.3.) 19
B.1.4.2. Oligonukleotide 20
B.2. Methoden 20
B.2.1. Herstellung synthetischer Gene 20
B.2.1.1. Entwurf der kodonoptimierten Gene 20
B.2.1.2. Aufbau eines synthetischen Gens 22
B.2.2. Molekularbiologische DNA-Präparations- und Klonierungsverfahren28
B.2.2.1. Enzymatische Spaltung von Nukleinsäuren 28
B.2.2.2. Agarose-Gelelektrophorese 28
B.2.2.3. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose 29
B.2.2.4. Ligation von DNA-Fragmenten 29
B.2.2.5. Herstellung transformationskompetenter Bakterien 29
B.2.2.6. Transformation von Plasmiden in E. coli 29
B.2.2.7. Präparation und Reinigung von Plasmid-DNA aus E. coli 30
B.2.2.8 PCR (polymerase chain reaction) 30
B.2.2.9. DNA-Sequenzierung 31
B.2.2.10. DNA-Sequenzierauswertung 33
B.2.3. Transfektion 34
B.2.3.1. Transfektion von adhärenten Zellen durch CaHPCVPräzipitation 34
B.2.3.2. Ernte und Aufarbeitung der Zellen und Zellkulturüberstände nach
Transfektion 34
B.2.4. Analyse von Proteinen 35
B.2.4.1. Quantitative Proteinbestimmung (BIORAD) 35
B.2.4.2. Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamid-
Gelelekrophorese 36
B.2.4.3. Detektion spezifischer Proteine mit Hilfe monoklonaler Antikörper37
B.2.4.3.1. Proteintransfer auf Nitrocellulose: Westem-Blot-Analyse 37
B.2.4.3.2. Detektion über eine Enzym/Substrat-vermittelte Farbreaktion 37
B.2.4.3.3. Detektion des VSV-G mittels monoklonalem Antikörper in der
FACS-Analyse 38
B.2.4.3.4 Antikörper 38
B.2.4.3.5 Proteinstandards 39
C. Ergebnisse 40
C.1. Voraussetzungen für eine sichere und effiziente Transduktion 40
C.2. pHIT/G als Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen 41
C.3. Herstellung des VSV G-Konstruktes auf der Basis des synthetischen
Leserahmens 41
C.4. Vergleich der Expressions- und Transduktionsergebnisse 43
C.4.1. Einfluss der RNA- und Codonoptimierung innerhalb der
kodierenden Sequenz auf die Expression des VSV-G Proteins 43
C.4.2. Einfluss heterologer 5- Signalpeptide auf die Expression und
Oberflächenexpression des VSV-G Proteins 45
C.4.3. Einfluss der verschiedenen Vektoren auf die Expression des
synthetisch hergestellten, kodonoptimierten VSV-G 49
C.4.4. Einfluss der verschiedenen Vektoren auf die Expression des
Wildtyp-VSV-G ohne den 3- untranslatierten Bereich 51
C.4.5. Einfluss der 3'- untranslatierten Region auf die Expression von
VSV-G in Abhängigkeit von Wildtyp- und synthetisch
hergestelltem, codonoptimiertem VSV-G 54
D. Diskussion 57
D.1. Anforderungen an Gentherapievektoren 57
D.2. Veränderte AS-Sequenz 58
D.3. Verschiedene Signalsequenzen 60
D.4. Nichtkodierende Sequenzen 61
D.5. Zytotoxizität 62
D.6. Ausblicke 63
D.6.1. Induzierbare Systeme 63
D.6.2. Weiterentwicklung der Gentherapievektoren 64
D.7. Rückschläge und Hoffnungen 65
E. Zusammenfassung 66
F. Anhang 68
F. 1. Oligonukleotide für die Herstellung synthetischer Gene 68
F.2. Codonoptimierte Sequenz im Vergleich zur Wildtypsequenz 72
F.3. Verwendete Klonierungs- und Expressionsvektoren 75
F.4. Abkürzungen 76
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