Entwicklung einer Methode zum Nachweis von EHEC in stark mischkontaminierten Umweltproben:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
Seite
1. EINLEITUNG 1
2. MATERIAL UND METHODEN 5
2.1. Vorversuche I - Auswahl und Kombination verschiedener
Untersuchungsmethoden 5
2.1.1. Die Probenkollektive 5
2.1.2. Probennahme und-bereitstellung 6
2.1.3. Homogenisierung und Anreicherung I 6
2.1.4. Immunomagnetische Separation 6
2.1.5. PCR 7
2.1.5.1. DNA-Denaturierung 7
2.1.5.2. PCR-Cycling 8
2.1.5.3. Gelelektrophorese und Dokumentation 8
2.1.6. Serologische Testung 8
2.2. Vorversuche II - Die Weiterentwicklung der Proben-
Aufbereitung 9
2.2.1. Die Probenkollektive 9
2.2.2. Probennahme und-bereitstellung 10
2.2.3. Homogenisierung und Anreicherung I 10
2.2.4. Immunomagnetische Separation 10
2.2.5. PCR 10
2.2.5.1. DNA-Denaturierung 11
2.2.5.2. PCR-Cycling 11
2.2.6. Serologische Testung 11
2.2.7. Untersuchungen zur Wasserqualität 11
2.3. Vergleich von PCR und seminested-PCR 12
2.3.1. Einfache PCR 12
2.3.2. Seminested-PCR 12
2.4. Hauptversuche 13
2.4.1. Anreicherung II im Selektivmedium 13
2.4.2. Seminested-PCR 13
2.4.3. Kolonieimmunoblot mit Doppelmembrantechnik 14
2.4.3.1. Anlage einer Kultur 14
2.4.3.2. Färbung der Nitrocellulosemembran 14
Inhaltsverzeichnis
2.4.4. Typisierung 15
2.4.4.1. Anlage einer Kultur 15
2.4.4.2. Biochemische Testung 15
2.4.4.3. Differenzierung der isolierten E. coli 15
3. ERGEBNISSE 17
3.1. Vorversuche I 17
3.1.1. Homogenisierung und Anreicherung I 17
ZA.2. Kultureller Nachweis nach Anreicherung I und serologischer
Testung 17
3.1.3. Durchführung der IMS 18
3.1.4. Kultureller Nachweis nach IMS und serologischer Testung 18
3.1.5. Genetischer Nachweis in der PCR 18
3.1.5.1. Spezifität der PCR 18
3.1.5.2. Nachweisgrenze der PCR 20
3.1.5.3. Untersuchung der Abwasser und Stuhlproben mit der PCR 20
3.2. Vorversuche II 21
3.2.1. Homogenisierung und Anreicherung I 22
3.2.2. Kultureller Nachweis nach Anreicherung I und serologischer
Testung 22
3.2.3. Durchführung der IMS 22
3.2.4. Kultureller Nachweis nach IMS und serologischer Testung 22
3.2.5. Genetischer Nachweis in der PCR 23
3.2.5.1. Nachweisgrenze der PCR 23
3.2.5.2. Untersuchung der Kläranlagen- und Schlachthofabwässer
mit der PCR 24
3.2.6. Untersuchungen zur Wasserqualität 24
3.3. Vergleich PCR -seminested-PCR 25
3.3.1. Nachweisgrenze der seminested PCR 25
3.3.2. Paralleluntersuchung von nativen Proben 26
3.4. Hauptversuche 26
3.4.1. Kultureller Nachweis 27
3.4.2. Untersuchung der Nativproben in der seminested-PCR 27
3.4.3. Untersuchungen der Nativproben mit dem Kolonieimmunoblot 28
4. DISKUSSION 32
4.1. Untersuchungsdiskussion 32
Inhaltsverzeichnis
4.2. Ergebnisdiskussion 37
5. ZUSAMMENFASSUNG 41
6. LITERATUR 43
ANHANG I
1 .A Gemeldete EHEC-Erkrankungen in Schleswig-Holstein für
den Zeitraum 01 /1997 - 09/1998 I
1.1.A Verteilung der EHEC-Serotypen I
1.2.A Verteilung der Erkrankten auf die Altersgruppen I
2.A Verwendete Primer für den Nachweis der Gene Verotoxin 1
und 2, Intimin und Enterohämolysin I
2.1.A Einfache PCR: Primer Nr. 1-10 I
2.2.A Seminested-PCR: Primer Nr. 11-22 II
3.A Verwendete Arttiseren zur Objektträger-Agglutination II
4.A Angaben zu Standort und Größe der beprobten Kläranlagen
(KA) und Schlachthöfe (SH) II
5.A Daten zur Wasserqualität der Probenkollektive: Kläranlagen
(KA), Schlachthöfe (SH) und Rindertränken (RT) III
5.1 A Kläranlagen und Schlachthöfe - Winterstichprobe 11/1997 -
03/1998 III
5.2.A Kläranlagen, Schlachthöfe und Rindertränken -
Sommerstichprobe 05/1998-09/1998 IM
6.A Kolonieimmunoblot positive Proben: genetische Merkmale
und typisierte Serovare IV
7.A PCR-Dokumentation V
8.A Referenzkeime auf Selektivmedien IX
9.A Kolonieimmunoblot mit Doppelmembrantechnik X
|
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Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
Seite
1. EINLEITUNG 1
2. MATERIAL UND METHODEN 5
2.1. Vorversuche I - Auswahl und Kombination verschiedener
Untersuchungsmethoden 5
2.1.1. Die Probenkollektive 5
2.1.2. Probennahme und-bereitstellung 6
2.1.3. Homogenisierung und Anreicherung I 6
2.1.4. Immunomagnetische Separation 6
2.1.5. PCR 7
2.1.5.1. DNA-Denaturierung 7
2.1.5.2. PCR-Cycling 8
2.1.5.3. Gelelektrophorese und Dokumentation 8
2.1.6. Serologische Testung 8
2.2. Vorversuche II - Die Weiterentwicklung der Proben-
Aufbereitung 9
2.2.1. Die Probenkollektive 9
2.2.2. Probennahme und-bereitstellung 10
2.2.3. Homogenisierung und Anreicherung I 10
2.2.4. Immunomagnetische Separation 10
2.2.5. PCR 10
2.2.5.1. DNA-Denaturierung 11
2.2.5.2. PCR-Cycling 11
2.2.6. Serologische Testung 11
2.2.7. Untersuchungen zur Wasserqualität 11
2.3. Vergleich von PCR und seminested-PCR 12
2.3.1. Einfache PCR 12
2.3.2. Seminested-PCR 12
2.4. Hauptversuche 13
2.4.1. Anreicherung II im Selektivmedium 13
2.4.2. Seminested-PCR 13
2.4.3. Kolonieimmunoblot mit Doppelmembrantechnik 14
2.4.3.1. Anlage einer Kultur 14
2.4.3.2. Färbung der Nitrocellulosemembran 14
Inhaltsverzeichnis
2.4.4. Typisierung 15
2.4.4.1. Anlage einer Kultur 15
2.4.4.2. Biochemische Testung 15
2.4.4.3. Differenzierung der isolierten E. coli 15
3. ERGEBNISSE 17
3.1. Vorversuche I 17
3.1.1. Homogenisierung und Anreicherung I 17
ZA.2. Kultureller Nachweis nach Anreicherung I und serologischer
Testung 17
3.1.3. Durchführung der IMS 18
3.1.4. Kultureller Nachweis nach IMS und serologischer Testung 18
3.1.5. Genetischer Nachweis in der PCR 18
3.1.5.1. Spezifität der PCR 18
3.1.5.2. Nachweisgrenze der PCR 20
3.1.5.3. Untersuchung der Abwasser und Stuhlproben mit der PCR 20
3.2. Vorversuche II 21
3.2.1. Homogenisierung und Anreicherung I 22
3.2.2. Kultureller Nachweis nach Anreicherung I und serologischer
Testung 22
3.2.3. Durchführung der IMS 22
3.2.4. Kultureller Nachweis nach IMS und serologischer Testung 22
3.2.5. Genetischer Nachweis in der PCR 23
3.2.5.1. Nachweisgrenze der PCR 23
3.2.5.2. Untersuchung der Kläranlagen- und Schlachthofabwässer
mit der PCR 24
3.2.6. Untersuchungen zur Wasserqualität 24
3.3. Vergleich PCR -seminested-PCR 25
3.3.1. Nachweisgrenze der seminested PCR 25
3.3.2. Paralleluntersuchung von nativen Proben 26
3.4. Hauptversuche 26
3.4.1. Kultureller Nachweis 27
3.4.2. Untersuchung der Nativproben in der seminested-PCR 27
3.4.3. Untersuchungen der Nativproben mit dem Kolonieimmunoblot 28
4. DISKUSSION 32
4.1. Untersuchungsdiskussion 32
Inhaltsverzeichnis
4.2. Ergebnisdiskussion 37
5. ZUSAMMENFASSUNG 41
6. LITERATUR 43
ANHANG I
1 .A Gemeldete EHEC-Erkrankungen in Schleswig-Holstein für
den Zeitraum 01 /1997 - 09/1998 I
1.1.A Verteilung der EHEC-Serotypen I
1.2.A Verteilung der Erkrankten auf die Altersgruppen I
2.A Verwendete Primer für den Nachweis der Gene Verotoxin 1
und 2, Intimin und Enterohämolysin I
2.1.A Einfache PCR: Primer Nr. 1-10 I
2.2.A Seminested-PCR: Primer Nr. 11-22 II
3.A Verwendete Arttiseren zur Objektträger-Agglutination II
4.A Angaben zu Standort und Größe der beprobten Kläranlagen
(KA) und Schlachthöfe (SH) II
5.A Daten zur Wasserqualität der Probenkollektive: Kläranlagen
(KA), Schlachthöfe (SH) und Rindertränken (RT) III
5.1 A Kläranlagen und Schlachthöfe - Winterstichprobe 11/1997 -
03/1998 III
5.2.A Kläranlagen, Schlachthöfe und Rindertränken -
Sommerstichprobe 05/1998-09/1998 IM
6.A Kolonieimmunoblot positive Proben: genetische Merkmale
und typisierte Serovare IV
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