Untersuchungen zur Wirkung des Bisphosphonates Clodronat nach exzitotoxischer Läsion in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen:
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2006
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|---|---|
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis VI
1 Einleitung 1
1.1 Traumatische Schädigungen des Zentralen Nervensystems 1
1.1.1 Das Trauma des ZNS 2
1.1.2 Die Pathophysiologie des ZNS Traumas 2
1.1.3 Die Behandlung des ZNS Traumas 5
1.2 Die Rolle und Funktion von Makrophagen und Mikrogliazellen 5
1.2.1 Die Entwicklungsgeschichte der Mikrogliazellen 6
1.2.2 Die Aktivierung von Mikrogliazellen 7
1.3 Eliminierung von Makrophagen/Mikrogliazellen nach einer trauma¬
tischen Schädigung des ZNS 9
1.4 Experimentelle Voraussetzungen 11
1.5 Fragestellung und Arbeitshypothesen 13
1.5.1 Arbeitshypothese 1 13
1.5.2 Arbeitshypothese 2 14
2 Materialien und Methoden 15
2.1 Verwendete Materialien 15
2.1.1 Verwendete Substanzen, Lösungen und Antikörper 15
2.1.2 Verwendete Puffer 16
2.1.3 Verwendete Geräte 17
2.2 Medien zur Präparation und Kultivierung von Schnittkulturen 17
2.2.1 Präparationsmedium 17
2.2.2 Kulturmedium 17
2.3 Herstellung der Agarblöcke 17
2.4 Herstellung der organotypischen hippokampalen Schnittkulturen 18
II
2.4.1 Vorbereitung des Arbeitsplatzes 18
2.4.2 Präparation der organotypischen hippokampalen Schnittkulturen ..18
2.5 Fixierung der Schnittkulturen 19
2.6 Experimentelle Gruppen 20
2.7 Fixierung der Schnittkulturen am 6. div 20
2.8 Langzeitexperimente 21
2.9 Markierung toter Zellen mittels Propidiumiodid 21
2.10 Färbemethoden 21
2.10.1 Immunhistochemie 21
2.10.2 Fluoreszenz Färbung 22
2.11 Auswertung 23
2.11.1 Beurteilung der Zytoarchitektur 23
2.11.2 Bestimmung der Zellzahlen 23
2.11.3 Statistische Auswertung 24
2.12 Proliferationsexperimente mit 5 Bromo 2 desoxyuridin 25
2.12.1 Immunhistochemie und quantitative Auswertung 25
2.12.2 Dreifach Färbung der Schnittkulturen 26
3 Ergebnisse 27
3.1 Ergebnisse der Clodronat Behandlung in ungeschädigten und
geschädigten Kulturen 27
3.1.1 In der Kontrollgruppe fanden sich ramifizierte Mikrogliazellen in
einer gut erhaltenen hippokampalen Zytoarchitektur 27
3.1.2 Die Behandlung ungeschädigter Kulturen mit Clodronat ab dem
6. div erbrachte keinen Unterschied im Vergleich
zur Kontrollgruppe 28
3.1.3 Die Behandlung ungeschädigter Kulturen mit Clodronat ab
0. div führte weder bezüglich der Anzahl IB4* Zellen noch
der Anzahl Pr Kerne zu Veränderungen im Vergleich zur
Kontrollgruppe 28
III
3.1.4 Die Schädigung der Kulturen mit NMDA resultierte In einer
zerstörten hippokampalen Zytoarchitektur und einer Akkumulation
amöboider Mikrogliazellen 29
3.1.5 Die Behandlung NMDA geschädigter Kulturen mit Clodronat ab
dem 6. div führte zu einer Verminderung der Anzahl der Mikroglia
Zellen 30
3.1.6 Die Clodronat Behandlung NMDA geschädigter Kulturen ab dem
0. div resultierte in einem stärkeren Rückgang der Anzahl der
Mikrogliazellen und einer vermehrten neuronalen Schädigung 31
3.2 Ergebnisse nach der Fixierung der Schnittkulturen am 6. div 32
3.2.1 In der Kontrollgruppe fanden sich wenige Mikrogliazellen mit
einer nicht einheitlichen Morphologie 32
3.2.2 Die Clodronat Behandlung ungeschädigter Kulturen
ergab bezüglich der neuronalen Schädigung und der
Anzahl und Verteilung der Mikrogliazellen keinen
Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe 32
3.3 Ergebnisse der Langzeitexperimente nach einer Fixierung der Kontroll¬
präparate und der mit Clodronat behandelten Präparate am 21. div 33
3.3.1 In der Kontrollgruppe waren bei relativ gutem neuronalen
Strukturerhalt amöboide Mikrogliazellen zu beobachten 33
3.3.2 Die Langzeitbehandlung ungeschädigter Kulturen
mit Clodronat resultierte in einer erhöhten Anzahl Pr Kerne
und einer fast vollständigen Elimination der Population
der Mikrogliazellen 33
3.4 Ergebnisse der Proliferationsexperimente mit 5 Bromo 2 desoxyuridin ...34
3.4.1 Die Kontrollgruppe enthielt wenige proliferierende BrdlT Kerne
mit einer uneinheitlichen Morphologie 34
3.4.2 Die Schädigung der Kulturen mit NMDA führte zu einem starken
Anstieg der Anzahl der BrdlT Keme 34
3.4.3 Die Behandlung der NMDA geschädigten Kulturen mit Clodronat
ab dem 6. div resultierte in einer erheblichen Verminderung der
Anzahl der BrdU+ Kerne 35
IV
3.4.4 Dreifachfärbung mit 5 Bromo 2 desoxyuridin, Isolektin B4 und
dem glialen fibrillären sauren Protein 35
3.4.4.1 Die wenigen BrdlT Kerne in der Kontrollgruppe wiesen
Doppelmarkierungen sowohl mit IB4 als auch mit
GFAPauf 35
3.4.4.2 In den NMDA geschädigten Kulturen war eine starke
Zunahme der Kolokalisation von BrdU und GFAP zu
beobachten 36
3.4.4.3 Die Behandlung NMDA geschädigter Kulturen mit Clo
dronat ab dem 6. div resultierte in einer Abnahme sowohl
der BrdlT Kerne, als auch der IB4+ und GFAP+ Zellen 36
3.5 Zusammenfassung der Ergebnisse 37
4 Diskussion 38
4.1 Immunologische Marker für Mikrogliazellen 38
4.2 Zur Arbeitshypothese 1: Wirkung des Bisphosphonates Clodronat auf
Mikrogliazellen 39
4.3 Wirkungsmechanismus von Clodronat 41
4.3.1 Klinische Anwendung von Clodronat 42
4.4 Hemmung der Proliferation aktivierter Mikrogliazellen durch Clodronat ....43
4.5 Zur Arbeitshypothese 2: Auswirkung der Eliminierung der
Mikrogliazellen auf das neuronale Überleben 45
4.6 Kontroverse Rolle aktivierter Mikrogliazellen/Makrophagen 47
4.6.1 Potentiell neuroprotektive Wirkungen von Mikroglia
Zellen/Makrophagen 47
4.6.2 Potentiell zytotoxische Rolle von Mikrogliazellen/Makro¬
phagen 49
4.7 Ausblick 52
5 Zusammenfassung 54
6 Summary 56
V
Literaturverzeichnis VII
Anhang A 1
Anhang 1: Abbildungsverzeichnis A 2
Anhang 2: Danksagung A 22
Anhang 3: Lebenslauf A 23
Anhang 4: Ehrenwörtliche Erklärung A 25
|
| adam_txt |
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis VI
1 Einleitung 1
1.1 Traumatische Schädigungen des Zentralen Nervensystems 1
1.1.1 Das Trauma des ZNS 2
1.1.2 Die Pathophysiologie des ZNS Traumas 2
1.1.3 Die Behandlung des ZNS Traumas 5
1.2 Die Rolle und Funktion von Makrophagen und Mikrogliazellen 5
1.2.1 Die Entwicklungsgeschichte der Mikrogliazellen 6
1.2.2 Die Aktivierung von Mikrogliazellen 7
1.3 Eliminierung von Makrophagen/Mikrogliazellen nach einer trauma¬
tischen Schädigung des ZNS 9
1.4 Experimentelle Voraussetzungen 11
1.5 Fragestellung und Arbeitshypothesen 13
1.5.1 Arbeitshypothese 1 13
1.5.2 Arbeitshypothese 2 14
2 Materialien und Methoden 15
2.1 Verwendete Materialien 15
2.1.1 Verwendete Substanzen, Lösungen und Antikörper 15
2.1.2 Verwendete Puffer 16
2.1.3 Verwendete Geräte 17
2.2 Medien zur Präparation und Kultivierung von Schnittkulturen 17
2.2.1 Präparationsmedium 17
2.2.2 Kulturmedium 17
2.3 Herstellung der Agarblöcke 17
2.4 Herstellung der organotypischen hippokampalen Schnittkulturen 18
II
2.4.1 Vorbereitung des Arbeitsplatzes 18
2.4.2 Präparation der organotypischen hippokampalen Schnittkulturen .18
2.5 Fixierung der Schnittkulturen 19
2.6 Experimentelle Gruppen 20
2.7 Fixierung der Schnittkulturen am 6. div 20
2.8 Langzeitexperimente 21
2.9 Markierung toter Zellen mittels Propidiumiodid 21
2.10 Färbemethoden 21
2.10.1 Immunhistochemie 21
2.10.2 Fluoreszenz Färbung 22
2.11 Auswertung 23
2.11.1 Beurteilung der Zytoarchitektur 23
2.11.2 Bestimmung der Zellzahlen 23
2.11.3 Statistische Auswertung 24
2.12 Proliferationsexperimente mit 5 Bromo 2' desoxyuridin 25
2.12.1 Immunhistochemie und quantitative Auswertung 25
2.12.2 Dreifach Färbung der Schnittkulturen 26
3 Ergebnisse 27
3.1 Ergebnisse der Clodronat Behandlung in ungeschädigten und
geschädigten Kulturen 27
3.1.1 In der Kontrollgruppe fanden sich ramifizierte Mikrogliazellen in
einer gut erhaltenen hippokampalen Zytoarchitektur 27
3.1.2 Die Behandlung ungeschädigter Kulturen mit Clodronat ab dem
6. div erbrachte keinen Unterschied im Vergleich
zur Kontrollgruppe 28
3.1.3 Die Behandlung ungeschädigter Kulturen mit Clodronat ab
0. div führte weder bezüglich der Anzahl IB4* Zellen noch
der Anzahl Pr Kerne zu Veränderungen im Vergleich zur
Kontrollgruppe 28
III
3.1.4 Die Schädigung der Kulturen mit NMDA resultierte In einer
zerstörten hippokampalen Zytoarchitektur und einer Akkumulation
amöboider Mikrogliazellen 29
3.1.5 Die Behandlung NMDA geschädigter Kulturen mit Clodronat ab
dem 6. div führte zu einer Verminderung der Anzahl der Mikroglia
Zellen 30
3.1.6 Die Clodronat Behandlung NMDA geschädigter Kulturen ab dem
0. div resultierte in einem stärkeren Rückgang der Anzahl der
Mikrogliazellen und einer vermehrten neuronalen Schädigung 31
3.2 Ergebnisse nach der Fixierung der Schnittkulturen am 6. div 32
3.2.1 In der Kontrollgruppe fanden sich wenige Mikrogliazellen mit
einer nicht einheitlichen Morphologie 32
3.2.2 Die Clodronat Behandlung ungeschädigter Kulturen
ergab bezüglich der neuronalen Schädigung und der
Anzahl und Verteilung der Mikrogliazellen keinen
Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe 32
3.3 Ergebnisse der Langzeitexperimente nach einer Fixierung der Kontroll¬
präparate und der mit Clodronat behandelten Präparate am 21. div 33
3.3.1 In der Kontrollgruppe waren bei relativ gutem neuronalen
Strukturerhalt amöboide Mikrogliazellen zu beobachten 33
3.3.2 Die Langzeitbehandlung ungeschädigter Kulturen
mit Clodronat resultierte in einer erhöhten Anzahl Pr Kerne
und einer fast vollständigen Elimination der Population
der Mikrogliazellen 33
3.4 Ergebnisse der Proliferationsexperimente mit 5 Bromo 2' desoxyuridin .34
3.4.1 Die Kontrollgruppe enthielt wenige proliferierende BrdlT Kerne
mit einer uneinheitlichen Morphologie 34
3.4.2 Die Schädigung der Kulturen mit NMDA führte zu einem starken
Anstieg der Anzahl der BrdlT Keme 34
3.4.3 Die Behandlung der NMDA geschädigten Kulturen mit Clodronat
ab dem 6. div resultierte in einer erheblichen Verminderung der
Anzahl der BrdU+ Kerne 35
IV
3.4.4 Dreifachfärbung mit 5 Bromo 2' desoxyuridin, Isolektin B4 und
dem glialen fibrillären sauren Protein 35
3.4.4.1 Die wenigen BrdlT Kerne in der Kontrollgruppe wiesen
Doppelmarkierungen sowohl mit IB4 als auch mit
GFAPauf 35
3.4.4.2 In den NMDA geschädigten Kulturen war eine starke
Zunahme der Kolokalisation von BrdU und GFAP zu
beobachten 36
3.4.4.3 Die Behandlung NMDA geschädigter Kulturen mit Clo
dronat ab dem 6. div resultierte in einer Abnahme sowohl
der BrdlT Kerne, als auch der IB4+ und GFAP+ Zellen 36
3.5 Zusammenfassung der Ergebnisse 37
4 Diskussion 38
4.1 Immunologische Marker für Mikrogliazellen 38
4.2 Zur Arbeitshypothese 1: Wirkung des Bisphosphonates Clodronat auf
Mikrogliazellen 39
4.3 Wirkungsmechanismus von Clodronat 41
4.3.1 Klinische Anwendung von Clodronat 42
4.4 Hemmung der Proliferation aktivierter Mikrogliazellen durch Clodronat .43
4.5 Zur Arbeitshypothese 2: Auswirkung der Eliminierung der
Mikrogliazellen auf das neuronale Überleben 45
4.6 Kontroverse Rolle aktivierter Mikrogliazellen/Makrophagen 47
4.6.1 Potentiell neuroprotektive Wirkungen von Mikroglia
Zellen/Makrophagen 47
4.6.2 Potentiell zytotoxische Rolle von Mikrogliazellen/Makro¬
phagen 49
4.7 Ausblick 52
5 Zusammenfassung 54
6 Summary 56
V
Literaturverzeichnis VII
Anhang A 1
Anhang 1: Abbildungsverzeichnis A 2
Anhang 2: Danksagung A 22
Anhang 3: Lebenslauf A 23
Anhang 4: Ehrenwörtliche Erklärung A 25 |
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