Vaskulärer Gentransfer der Antikoagulantien tPA und Hirudin durch lokale Transplantation retroviral-transduzierter Endothelvorläuferzellen: Untersuchungen am Carotis-Angioplastie-Modell der erwachsenen Ratte
Gespeichert in:
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| Veröffentlicht: |
2006
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| Beschreibung: | Regensburg, Univ., Diss., 2006 |
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|---|---|
| adam_text | Titel: Vaskulärer Gentransfer der Antikoagulantien tPA und Hirudin durch lokale Transplantation retroviral
Autor: Achatz, Stefan
Jahr: 2006
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Stammzellen und Endothelprogenitorzellen 1
1.2 elnfluss von gerrnnungsfaktoren auf die restenosierung
nach angioplast1e 3
1.2.1 Angioptastie 3
1.2.2 Gerinnungsfaktoren undRestenosierung 3
1.2.2.1 Hirudin 3
1.2.2.2 Tissue Plasminogen Aktivator 4
1.3 Retroviren 5
1.3.1 Retroviren in der Gentherapie 5
1.3.1.1 Ansätze für retrovirale Gentherapie 5
1.3.1.1.1 Bekämpfung von Tumoren 5
1.3.1.1.2 Bekämpfung von Infektionskrankheiten 6
1.3.1.1.3 Korrektur von Erbkrankheiten 6
1.3.1.1.4 Lokales Drug-Delivery 6
1.3.1.2 Voraussetzungen für eine erfolgreiche retrovirale Gentherapie
im hämatompoetischen System 7
1.3.1.2.1 Stammzelltransduktion 7
1.3.1.2.2 Transgen-Expression 7
1.3.2 Allgemeine Eigenschaften von Retroviren 7
1.3.2.1 Klassifikation U
1.3.2.2 Genom 11
1.3.2.3 Genexpression 13
1.3.2.4 Grundlegendes Prinzip retroviraler Vektoren 14
1.4 Spezifische Ziele der Arbeit 16
I
Inhaltsverzeichnis
2 MATERIAL UND METHODEN 17
2.1 KLONIERUNG RETROVIRALER KONSTRU1CTE 17
2.1.1 Restriktionsenzymverdau von Plasmiden 17
2.1.2 Agarosegelelektrophorese 17
2.1.3 DNA - Extraktion aus Agarosegel 18
2.1.4 DNA Ligation von Plasmiden 18
2.1.5 Elektrotransformation von kompetenten E.coli mit Plasmid-DNA 19
2.1.6 Mini-präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien 19
2.1.7 Maxi-präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien 20
2.2 Herstellung rekombinanter, muriner, replikations-defekter
Retroviren 21
2.2.1 Zellkultur von NIH/3T3-Zellen und 293T-Zellen 21
2.2.2 Produktion rekombinanter Retroviren durch DNAICaPOrPräzipitat-
Transfektion in 293T-Zellen 21
2.2.3 Bestimmung des infektiösen Titers eines Retrovirus mit Hilfe von 3T3-Zellen . 24
2.3 Isolation und Charakterisierung endotheualer Vorläuferzellen 25
2.3.1 Generierung endothelialer Zellen aus dem Knochenmark
der erwachsenen Ratte 25
2.3.2 Generierung endothelialer Zellen aus peripherem Blut
der erwachsenen Ratte 26
2.3.3 FACS Analyse 26
2.3.4 Tube Formation Assay 27
2.3.5 Immunhistochemie der Stammzellen und Gefäßschnitte 28
2.3.6 Dil-ac-LDL Cholesterol Aufnahme 30
2.3.7 RNA-Extraktion und Quantifizierung 31
2.3.8 Reverse Transkriptase Pofymerase-Ketten-Reaktion 31
2.4 Nachweis des Transduktionserfolges und der sezernierten
Transgenprodukte in mm Im vivo 33
2.4.1 Proteinextraktion aus Gefäßen 33
II
Inhaltsverzeichnis
2.4.2 ImmunpräzipitationfirtPA undHirudin 34
2.4.3 Western-blot 35
2.4.4 Hirudin - Elisa ItPA - Elisa 37
2.4.5 tPA-Aktivitätsassay 38
2.5 ANGIOPLASTIE UND ZELLTRANSPLANTATION IN VIVO 39
2.5.1 Angioplastiemodell an der Ratte und Zelltransplantation 39
2.5.2 Bestimmung des prozentualen Oberflächenanteils der retroviral
transduzierten EPZ in Gefäßen nach Angioplastie und Transplantation 40
2.5.3 Häntatoxylin - Eosin - Färbung 40
2.6 Statistische Analyse 41
3 ERGEBNISSE 42
3.1 Herstellung rekombinanter, muriner, replikations-defekter
RETROVIREN 42
3.1.1 Klonienmg des KonstruktespC.MMP-GH.Hirudin.6His-IRES-eGFP 42
3.1.2 Klonierung des Konstruktes pC.MMP-hu.tPA-IRES-eGFP 44
3.1.3 Herstellung funktionsfähiger Retroviren 44
3.1.4 Bestimmung des infektiösen Titers der hergestellten Retroviren 46
3.2 Isolation und Charakterisierung endothelialer Vorlauferzellen 47
3.2.1 Isolation und Kultur der EPZ 47
3.2.2 Charakterisierung endothelialer Vorläuferzellen 48
3.2.2.1 FACS - Analyse nach Markierung mit CD45 - Antikörper 48
3.2.2.2 FACS - Analyse nach Markierung mit CD54-1CAM und
CD90 - Antikörper 48
3.2.2.3 FACS - Analyse nach Markierung mit UEA-1-lectin 49
3.2.2.4 Tube Formation Assay 50
3.2.2.5 Immunhistochemie 51
3.2.2.6 LDL - Cholesterol Aufnahme 52
3.2.2.7 RT- PCR 53
III
Inhaltsverzeichnis
3.3 Nachweis des Transduktionserfolges und der sezernierten
Transgenprodukte 54
3.3.1 FACS - Analyse der eGFP-transduzierten EPZ 54
3.3.2 Nachweis der sezernierten Genprodukte in vitro 55
3.3.2.1 Immunpräzipitation 55
3.3.2.2 Hirudin - ELBA 56
3.3.2.3 tPA-ELISA 57
3.3.2.4 tPA - Aktivitätsassay 58
3.4 Transplantation und Nachweis genetisch modifizierter
Endothelvorläuferzellen in der Gefäbwand 59
3.4.1 Etablierung der experimentellen Angioplastie der Arteria Carotis Communis
der Ratte 59
3.4.2 Bestimmung der Besiedelungsdichte der Geßßoberfläche nach
Zelltransplantation 61
3.4.3 Immunhistochemischer Nachweis der transplantierten Zellen 63
3.4.4 Western-blot-Analyse der Proteinextrakte aus Gefäßen 64
3.5 Nachweis der sezernierten Genprodukte Hirudin und tPA in vivo 65
3.6 Auswirkung der unmittelbaren Reendothelialisierung mit EPZ auf
DAS VASKULÄRE REMODELLING NACH EXPERIMENTELLER ANGIOPLASTIE 67
3.6.1 Anfertigung histologischer Querschnitte 67
3.6.2 Auswirkungen auf den Gefäßdurchmesser 69
3.6.3 Auswirkungen auf die Mediafläche im Querschnitt 70
3.6.4 Auswirkungen auf die Neointimabildung 71
4 DISKUSSION 72
5 LITERATURVERZEICHNIS 78
IV
|
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Titel: Vaskulärer Gentransfer der Antikoagulantien tPA und Hirudin durch lokale Transplantation retroviral
Autor: Achatz, Stefan
Jahr: 2006
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Stammzellen und Endothelprogenitorzellen 1
1.2 elnfluss von gerrnnungsfaktoren auf die restenosierung
nach angioplast1e 3
1.2.1 Angioptastie 3
1.2.2 Gerinnungsfaktoren undRestenosierung 3
1.2.2.1 Hirudin 3
1.2.2.2 Tissue Plasminogen Aktivator 4
1.3 Retroviren 5
1.3.1 Retroviren in der Gentherapie 5
1.3.1.1 Ansätze für retrovirale Gentherapie 5
1.3.1.1.1 Bekämpfung von Tumoren 5
1.3.1.1.2 Bekämpfung von Infektionskrankheiten 6
1.3.1.1.3 Korrektur von Erbkrankheiten 6
1.3.1.1.4 Lokales Drug-Delivery 6
1.3.1.2 Voraussetzungen für eine erfolgreiche retrovirale Gentherapie
im hämatompoetischen System 7
1.3.1.2.1 Stammzelltransduktion 7
1.3.1.2.2 Transgen-Expression 7
1.3.2 Allgemeine Eigenschaften von Retroviren 7
1.3.2.1 Klassifikation U
1.3.2.2 Genom 11
1.3.2.3 Genexpression 13
1.3.2.4 Grundlegendes Prinzip retroviraler Vektoren 14
1.4 Spezifische Ziele der Arbeit 16
I
Inhaltsverzeichnis
2 MATERIAL UND METHODEN 17
2.1 KLONIERUNG RETROVIRALER KONSTRU1CTE 17
2.1.1 Restriktionsenzymverdau von Plasmiden 17
2.1.2 Agarosegelelektrophorese 17
2.1.3 DNA - Extraktion aus Agarosegel 18
2.1.4 DNA Ligation von Plasmiden 18
2.1.5 Elektrotransformation von kompetenten E.coli mit Plasmid-DNA 19
2.1.6 Mini-präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien 19
2.1.7 Maxi-präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien 20
2.2 Herstellung rekombinanter, muriner, replikations-defekter
Retroviren 21
2.2.1 Zellkultur von NIH/3T3-Zellen und 293T-Zellen 21
2.2.2 Produktion rekombinanter Retroviren durch DNAICaPOrPräzipitat-
Transfektion in 293T-Zellen 21
2.2.3 Bestimmung des infektiösen Titers eines Retrovirus mit Hilfe von 3T3-Zellen . 24
2.3 Isolation und Charakterisierung endotheualer Vorläuferzellen 25
2.3.1 Generierung endothelialer Zellen aus dem Knochenmark
der erwachsenen Ratte 25
2.3.2 Generierung endothelialer Zellen aus peripherem Blut
der erwachsenen Ratte 26
2.3.3 FACS Analyse 26
2.3.4 Tube Formation Assay 27
2.3.5 Immunhistochemie der Stammzellen und Gefäßschnitte 28
2.3.6 Dil-ac-LDL Cholesterol Aufnahme 30
2.3.7 RNA-Extraktion und Quantifizierung 31
2.3.8 Reverse Transkriptase Pofymerase-Ketten-Reaktion 31
2.4 Nachweis des Transduktionserfolges und der sezernierten
Transgenprodukte in mm Im vivo 33
2.4.1 Proteinextraktion aus Gefäßen 33
II
Inhaltsverzeichnis
2.4.2 ImmunpräzipitationfirtPA undHirudin 34
2.4.3 Western-blot 35
2.4.4 Hirudin - Elisa ItPA - Elisa 37
2.4.5 tPA-Aktivitätsassay 38
2.5 ANGIOPLASTIE UND ZELLTRANSPLANTATION IN VIVO 39
2.5.1 Angioplastiemodell an der Ratte und Zelltransplantation 39
2.5.2 Bestimmung des prozentualen Oberflächenanteils der retroviral
transduzierten EPZ in Gefäßen nach Angioplastie und Transplantation 40
2.5.3 Häntatoxylin - Eosin - Färbung 40
2.6 Statistische Analyse 41
3 ERGEBNISSE 42
3.1 Herstellung rekombinanter, muriner, replikations-defekter
RETROVIREN 42
3.1.1 Klonienmg des KonstruktespC.MMP-GH.Hirudin.6His-IRES-eGFP 42
3.1.2 Klonierung des Konstruktes pC.MMP-hu.tPA-IRES-eGFP 44
3.1.3 Herstellung funktionsfähiger Retroviren 44
3.1.4 Bestimmung des infektiösen Titers der hergestellten Retroviren 46
3.2 Isolation und Charakterisierung endothelialer Vorlauferzellen 47
3.2.1 Isolation und Kultur der EPZ 47
3.2.2 Charakterisierung endothelialer Vorläuferzellen 48
3.2.2.1 FACS - Analyse nach Markierung mit CD45 - Antikörper 48
3.2.2.2 FACS - Analyse nach Markierung mit CD54-1CAM und
CD90 - Antikörper 48
3.2.2.3 FACS - Analyse nach Markierung mit UEA-1-lectin 49
3.2.2.4 Tube Formation Assay 50
3.2.2.5 Immunhistochemie 51
3.2.2.6 LDL - Cholesterol Aufnahme 52
3.2.2.7 RT- PCR 53
III
Inhaltsverzeichnis
3.3 Nachweis des Transduktionserfolges und der sezernierten
Transgenprodukte 54
3.3.1 FACS - Analyse der eGFP-transduzierten EPZ 54
3.3.2 Nachweis der sezernierten Genprodukte in vitro 55
3.3.2.1 Immunpräzipitation 55
3.3.2.2 Hirudin - ELBA 56
3.3.2.3 tPA-ELISA 57
3.3.2.4 tPA - Aktivitätsassay 58
3.4 Transplantation und Nachweis genetisch modifizierter
Endothelvorläuferzellen in der Gefäbwand 59
3.4.1 Etablierung der experimentellen Angioplastie der Arteria Carotis Communis
der Ratte 59
3.4.2 Bestimmung der Besiedelungsdichte der Geßßoberfläche nach
Zelltransplantation 61
3.4.3 Immunhistochemischer Nachweis der transplantierten Zellen 63
3.4.4 Western-blot-Analyse der Proteinextrakte aus Gefäßen 64
3.5 Nachweis der sezernierten Genprodukte Hirudin und tPA in vivo 65
3.6 Auswirkung der unmittelbaren Reendothelialisierung mit EPZ auf
DAS VASKULÄRE REMODELLING NACH EXPERIMENTELLER ANGIOPLASTIE 67
3.6.1 Anfertigung histologischer Querschnitte 67
3.6.2 Auswirkungen auf den Gefäßdurchmesser 69
3.6.3 Auswirkungen auf die Mediafläche im Querschnitt 70
3.6.4 Auswirkungen auf die Neointimabildung 71
4 DISKUSSION 72
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