Globale Analyse der differentiellen Genexpression intestinaler Fibroblasten aus stenosierten und nicht stenosierten Darmabschnitten von Morbus Crohn-Patienten:
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| adam_text | Titel: Globale Analyse der differentiellen Genexpression intestinaler Fibroblasten aus stenosierten und nic
Autor: Lang, Markus
Jahr: 2006
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Morbus Crohn und Colitis uIcerosa 1
1.2 Aufbau der Darmwand 3
1.3 Fibroblasten und Myofibroblasten 5
1.4 Stenosenbildung bei Morbus Crohn und die Bedeutung intestinaler 7
Fibroblasten
1.5 Differentielle Genexpression von Myofibroblasten bei der 11
Entstehung von Fibrösen am Beispiel der Leber
1.5.1 Aktivierung und Differenzierung hepatischer Sternzellen 11
1.5.2 Differentielle Genexpression auf Proteinebene 12
1.5.3 Differentielle Genexpression auf mRNA-Ebene 15
2 Arbeitsziele 18
3 Material 20
3.1 Herkunft von Material und Geräten 20
3.2 Fertigkombinationen von Biochemikalien 24
3.3 Oligonukleotide 24
3.4 Adaptoren 25
3.5 DNA Größenstandard 25
3.6 Organismus und Vektor 26
3.7 Nährmedien und Antibiotika 26
3.8 Puffer und Lösungen 27
III
4 Methoden 31
4.1 Zellkultur 31
4.1.1 Isolation und Kultur von primären humanen intestinalen Fibroblasten 31
4.1.2 Allgemeine Zellkulturtechniken 32
4.1.2.1 Bestimmung der Zellzahl 32
4.1.2.2 Einfrieren von Zellen 32
4.1.2.3 Auftauen von Zellen 33
4.2 RNA-Isolation 33
4.2.1 potyA mRNA-lsolation 33
4.2.2 Gesamt RNA-Isolation 34
4.2.3 RNA-Konzerrtrationsbestirnrnung 34
4.3 PCR-Select™ cDNA Subtraktion 35
4.3.1 Synthese doppelsträngiger cDNA 35
4.3.2 cDIMA Verdau 37
4.3.3 Ligation der Adaptoren 37
4.3.4 Hybridisierungen 40
4.3.5 Nested PCR 41
4.4 Gelelektrophorese 43
4.4.1 DNA-Isolation aus Agarosegel 43
4.4.2 Polyacrylamid Gelelektrophorese 43
4.4.3 DNA-Isolation aus Polyacrylamidgel 44
4.5 Autoradiographie 45
4.6 DNA-Klonierung 45
4.7 Aufreinigung von Plasmid-DNA 46
4.8 Sequenzierung und Sequenzvergleich 46
4.9 Dot Blot 46
4.9.1 cDNA-Transfer 47
4.9.2 Radioaktive Markierung und Aufreinigung der cDNA 48
4.9.3 Hybridisierung und Waschen 49
IV
4.10 Affymetrix® Microarray Analysen 50
5 Ergebnisse 53
5.1 Subtraktives screening 53
5.1.1 Vergleich von Morbus Crohn-Fibroblasten aus nicht stenosierten Arealen 55
mit Kontrollfibroblasten
5.1.2 Vergleich von Morbus Crohn-Fibroblasten aus Stenosen mit 64
Kontrollfibroblasten
5.1.2.1 Subtraktion der Kontrollfibroblasten von Morbus Crohn-Fibroblasten aus 64
Stenosen
5.1.2.2 Subtraktion der Morbus Crohn-Fibroblasten aus Stenosen von 72
Kontrollfibroblasten
5.1.3 Vergleich von Morbus Crohn-Fibroblasten aus nicht stenosierten Arealen 75
mit Fibroblasten aus Stenosen
5.1.3.1 Subtraktion der Morbus Crohn-Fibroblasten aus nicht stenosierten 75
Arealen von Fibroblasten aus Stenosen
5.1.3.2 Subtraktion der Fibroblasten aus Stenosen von Morbus Crohn- 77
Fibroblasten aus nicht stenosierten Arealen
5.2 Affymetrix* Microarray Analysen 79
5.2.1 Vergleich des Genexpressionsmusters von Morbus Crohn-Fibroblasten 81
aus nicht stenosierten Arealen mit Kontrollfibroblasten
5.2.2 Vergleich des Genexpressionsmusters von Morbus Crohn-Fibroblasten 83
aus Stenosen mit Kontrollfibroblasten
5.2.3 Vergleich des Genexpressionsmusters von Morbus Crohn-Fibroblasten 87
aus nicht stenosierten Arealen mit Fibroblasten aus Stenosen
5.3 Zusammenfassung der Ergebnisse 90
6 Diskussion 102
6.1 Bewertung der Ergebnisse im Hinblick auf die angewandten 103
Methoden
6.1.1 Die Überrepräsentierung kurzer mRNA-MolekQle 103
6.1.2 Falsch-positive Ergebnisse der SSH 104
6.1.3 Die Wertigkeit von Genen, die sich nicht durch Dot Blots bestätigten 104
6.1.4 Die geringe Übereinstimmung von SSH-und Microarray-Engebnissen 107
V
6.1.5 Der Einfluss biologischer Schwankungen 108
6.2 DHferentiell exprimierte Gene und ihre mögliche Bedeutung beim 110
Morbus Crohn
6.2.1 Fibronektin 110
6.2.2 Expression weiterer extrazellulärer Matrixkomponenten 112
6.2.3 Gewebedegradierende Enzyme 118
6.2.4 Interteukin8 121
6.2.5 Humanes kartilaginares Glykoprotein 39 122
6.2.6 Glycoprotein (transmembrane) nmb 124
6.2.7 RhoA 125
6.2.8 Stromal cetl-derived factor-1 126
7 Zusammenfassung 128
8 Literaturverzeichnis 130
9 Danksagung 145
VI
|
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Titel: Globale Analyse der differentiellen Genexpression intestinaler Fibroblasten aus stenosierten und nic
Autor: Lang, Markus
Jahr: 2006
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Morbus Crohn und Colitis uIcerosa 1
1.2 Aufbau der Darmwand 3
1.3 ' Fibroblasten und Myofibroblasten 5
1.4 Stenosenbildung bei Morbus Crohn und die Bedeutung intestinaler 7
Fibroblasten
1.5 Differentielle Genexpression von Myofibroblasten bei der 11
Entstehung von Fibrösen am Beispiel der Leber
1.5.1 Aktivierung und Differenzierung hepatischer Sternzellen 11
1.5.2 Differentielle Genexpression auf Proteinebene 12
1.5.3 Differentielle Genexpression auf mRNA-Ebene 15
2 Arbeitsziele 18
3 Material 20
3.1 Herkunft von Material und Geräten 20
3.2 Fertigkombinationen von Biochemikalien 24
3.3 Oligonukleotide 24
3.4 Adaptoren 25
3.5 DNA Größenstandard 25
3.6 Organismus und Vektor 26
3.7 Nährmedien und Antibiotika 26
3.8 Puffer und Lösungen 27
III
4 Methoden 31
4.1 Zellkultur 31
4.1.1 Isolation und Kultur von primären humanen intestinalen Fibroblasten 31
4.1.2 Allgemeine Zellkulturtechniken 32
4.1.2.1 Bestimmung der Zellzahl 32
4.1.2.2 Einfrieren von Zellen 32
4.1.2.3 Auftauen von Zellen 33
4.2 RNA-Isolation 33
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4.3.3 Ligation der Adaptoren 37
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4.3.5 Nested PCR 41
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4.4.1 DNA-Isolation aus Agarosegel 43
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4.4.3 DNA-Isolation aus Polyacrylamidgel 44
4.5 Autoradiographie 45
4.6 DNA-Klonierung 45
4.7 Aufreinigung von Plasmid-DNA 46
4.8 Sequenzierung und Sequenzvergleich 46
4.9 Dot Blot 46
4.9.1 cDNA-Transfer 47
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IV
4.10 Affymetrix® Microarray Analysen 50
5 Ergebnisse 53
5.1 Subtraktives screening 53
5.1.1 Vergleich von Morbus Crohn-Fibroblasten aus nicht stenosierten Arealen 55
mit Kontrollfibroblasten
5.1.2 Vergleich von Morbus Crohn-Fibroblasten aus Stenosen mit 64
Kontrollfibroblasten
5.1.2.1 Subtraktion der Kontrollfibroblasten von Morbus Crohn-Fibroblasten aus 64
Stenosen
5.1.2.2 Subtraktion der Morbus Crohn-Fibroblasten aus Stenosen von 72
Kontrollfibroblasten
5.1.3 Vergleich von Morbus Crohn-Fibroblasten aus nicht stenosierten Arealen 75
mit Fibroblasten aus Stenosen
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Fibroblasten aus nicht stenosierten Arealen
5.2 Affymetrix* Microarray Analysen 79
5.2.1 Vergleich des Genexpressionsmusters von Morbus Crohn-Fibroblasten 81
aus nicht stenosierten Arealen mit Kontrollfibroblasten
5.2.2 Vergleich des Genexpressionsmusters von Morbus Crohn-Fibroblasten 83
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5.2.3 Vergleich des Genexpressionsmusters von Morbus Crohn-Fibroblasten 87
aus nicht stenosierten Arealen mit Fibroblasten aus Stenosen
5.3 Zusammenfassung der Ergebnisse 90
6 Diskussion 102
6.1 Bewertung der Ergebnisse im Hinblick auf die angewandten 103
Methoden
6.1.1 Die Überrepräsentierung kurzer mRNA-MolekQle 103
6.1.2 Falsch-positive Ergebnisse der SSH 104
6.1.3 Die Wertigkeit von Genen, die sich nicht durch Dot Blots bestätigten 104
6.1.4 Die geringe Übereinstimmung von SSH-und Microarray-Engebnissen 107
V
6.1.5 Der Einfluss biologischer Schwankungen 108
6.2 DHferentiell exprimierte Gene und ihre mögliche Bedeutung beim 110
Morbus Crohn
6.2.1 Fibronektin 110
6.2.2 Expression weiterer extrazellulärer Matrixkomponenten 112
6.2.3 Gewebedegradierende Enzyme 118
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9 Danksagung 145
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