Alle Abbildungen des Buches Bioanalytik:
Gespeichert in:
| Format: | Elektronisch Software E-Book |
|---|---|
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München [u.a.]
Elsevier, Spektrum Akad. Verl.
2006
|
| Ausgabe: | 2. Aufl. |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 1 CD-ROM 12 cm Beil. (4 S.) |
| Format: | Windows 98/98SE/98ME/NT4.0 SP2/2000/XP. - Arbeitsspeicher: ab 64 MB, je nach Betriebssystem; Bildschirm: 1024 x 768 Bildpunkte, 16 Bit Farbe und höher. - Software: Internet Explorer ab 5.x + JavaScript; Netscape ab 6.0 + JavaScript; Firefox 1.0 + JavaScript, u.ä. Mac OS 9/ OS X. - Hardware wie Windows. - Software: Internet Explorer ab 4.x + JavaScript; Netscape ab 6.0 + JavaScript; Firefox 1.0 + JavaScript, u.ä. Linux. - Arbeitsspeicher: ab 256 MB, je nach Grafiksystem; sonst wie Windows. - Netscape ab 6.0 + Javasript, Firefox 1.0 + JavaScript, u.ä. |
| ISBN: | 9783827417602 3827417600 |
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Inhaltsübersicht
1 Bioanalytik eine eigenständige Wissenschaft 1
Teil I Proteinanalytik
2 Proteinreinigung 13
3 Proteinbestimmungen 35
4 Enzymatische Aktivitätstests 47
5 Immunologische Techniken 61
6 Chemische Modifikation von Proteinen und
Proteinkomplexen 103
7 Spektroskopie 129
8 Lichtmikroskopische Verfahren Imaging 175
9 Spaltung von Proteinen 201
10 Chromatographische Trennmethoden 215
11 Elektrophoretische Verfahren 235
12 Kapillarelektrophorese 269
13 Aminosäureanalyse 299
14 Proteinsequenzanalyse 311
15 Massenspektrometrie 329
16 Protein Protein Wechselwirkungen:
das two hvbrid System und andere Methoden 373
Teil II 3D Strukturaufklärung
17 Magnetische Resonanzspektroskopie von
Biomolekülen 407
18 Elektronenmikroskopie 461
19 Rasterkraftmikroskopie 495
20 Röntgenstrukturanalyse 503
Teil III Spezielle Stoffgruppen
21 Analytik synthetischer Peptide 517
22 Kohlenhydratanalytik 533
23 Lipidanalytik 581
24 Analytik posttranslationaler Modifikationen:
Phosphorylierung und Acetylierung von Proteinen 613
Teil IV Nucleinsäureanalytik
25 Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren 633
26 Aufarbeitung von Nucleinsäuren 653
27 Hybridisierung und Nachweistechniken 701
28 Polymerasekettenreaktion 743
29 DNA Sequenzierung 777
30 Gezielte Genmodifikation in der Maus 805
31 Analyse der genomischen DNA Methylierung 821
32 Protein Nucleinsäure Wechselwirkungen 833
Teil V Systematische Funktions¬
analytik
33 Sequenzanalyse 879
34 Analyse von Promotorstärke und aktiver
RNA Synthese 971
35 Fluoreszenzmarkierte DNA Hybridisierung zur
Genomanalyse in der molekularen Cytogenetik 923
36 Physikalische und genetische Genkartierung 935
37 Differenzielle Genaktivität 957
38 DNA Microarray Technologie 967
39 Oligonucleotide als zellbiologische Werkzeuge 979
40 Proteomanalyse 995
41 Metabolomics und Peptidomics 1017
42 Interactomics Systematische Protein Protein
Wechselwirkungen 1027
43 Toponomanalyse 1035
44 Systembiologie 1055
Anhang
Anhang 1: Strahlenschutz im Labor 1067
Anhang 2: Aminosäuren und posttranslationale
Modifikationen 1093
Anhang 3: Symbole und Abkürzungen 1095
Index 1101
Inhalt
Vorwort V
Autoren XXI
1 Bioanalytik eine eigenständige Wissenschaft 1
1.1 Paradigmenwechsel in der Biochemie:
Von der Proteinchemie zur Systembiologie 2
1.1.1 Klassische Strategie 2
1.1.2 Holistische Strategie 2
1.2 Methoden begründen Fortschritt 3
1.2.1 Proteinanalytik 5
1.2.2 Molekularbiologie 6
1.2.3 Bioinformatik 7
1.2.4 Funktionsanalyse 7
Teil I Proteinanalytik
2 Proteinreinigung 13
2.1 Eigenschaften von Proteinen 13
2.2 Proteinlokalisation und Reinigungsstrategie 16
2.3 Homogenisierung und Zellaufschluss 17
2.4 Die Fällung 20
2.5 Zentrifugation 21
2.5.1 Grundlagen 22
2.5.2 Zentrifugationstechniken 24
2.6 Abtrennung von Salzen oder hydrophilen
Verunreinigungen 26
2.7 Konzentrierung 28
2.8 Detergenzien und ihre Entfernung 29
2.8.1 Eigenschaften von Detergenzien 29
2.8.2 Entfernen von Detergenzien 32
2.9 Probenvorbereitung für die Proteomanalyse 33
Weiterführende Literatur 33
3 Proteinbestimmungen 35
3.1 Quantitative Bestimmung durch Färbetests 37
3.1.1 Biuret Assay 38
3.1.2 Lowry Assay 38
3.1.3 Bicinchoninsäure Assay (BCA Assay) 39
3.1.4 Bradford Assay 40
3.2 Spektroskopische Methoden 41
3.2.1 Messungen im UV Bereich 41
3.2.2 Fluoreszenzmethode 43
3.3 Radioaktive Markierung von Peptiden
und Proteinen 44
3.3.1 Iodierungen 46
Weiterführende Literatur 46
XII Inhalt
6.2.2 Untersuchungen an überexprimierten oder
mutierten Proteinen 116
6.3 Protein cross linking zur Analyse von
Proteinwechselwirkungen 117
6.3.1 Bifunktionelle Reagenzien 118
6.3.2 Photoaffinitätsmarkierung 118
Weiterführende Literatur 127
7 Spektroskopie 129
7.1 Physikalische Prinzipien und Messtechniken 130
7.1.1 Physikalische Grundlagen optischer
spektroskopischer Messmethoden 130
7.1.2 Wechselwirkung Licht Materie 130
7.1.3 Absorptionsmessungen 138
7.1.4 Photometer 141
7.1.5 Kinetische spektroskopische Untersuchungen 142
7.2 UV/VIS/NIR Spektroskopie 144
7.2.1 Grundlagen 144
7.2.2 Chromoproteine 145
7.3 IR Spektroskopie 152
7.3.1 Grundlagen 152
7.3.2 Molekiilschwingungen 153
7.3.3 Messtechniken 155
7.3.4 Infrarotspektroskopie von Proteinen 158
7.4 Raman Spektroskopie 160
7.4.1 Grundlagen 160
7.4.2 Raman Experimente 161
7.4.3 Resonanz Raman Spektroskopie 163
7.5 Fluoreszenzspektroskopie 164
7.5.1 Grundlagen 164
7.5.2 Fluoreszenzspektren als Emissionsspektren
und als Aktionsspektren 166
7.5.3 Fluoreszenzuntersuchungen mit intrinsischen
und extrinsischen Fluorophoren 168
7.6 Methoden mit polarisiertem Licht 169
7.6.1 Lineardichroismus 169
7.6.2 Optische Rotationsdispersion und
Circulardichroismus 172
Weiterführende Literatur 174
8 Lichtmikroskopische Verfahren Imaging 175
8.1 Wegbereiter der Mikroskopie von einfachen
Linsen zu hoch auflösenden Mikroskopen 175
8.2 Moderne Anwendungsbereiche 176
8.3 Physikalische Grundlagen 177
8.4 Nachweismethoden 183
8.5 Präparationsmethoden 190
8.6 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie 193
8.7 Live cell imaging 194
Weiterführende Literatur 199
Internetseiten 200
9 Spaltung von Proteinen 201
9.1 Proteolytische Enzyme 201
9.2 Strategie 202
9.3 Denaturierung 203
9.4 Spaltung von Disulfidbrücken und Alkylierung 203
9.5 Enzymatische Fragmentierung 205
9.5.1 Proteasen 206
9.5.2 Proteolysebedingungen 210
9.6 Chemische Fragmentierung 211
9.7 Ausblick 214
Weiterführende Literatur 214
10 Chromatographische Trennmethoden 215
10.1 Prinzip der Chromatographie 215
10.1.1 Grundbegriffe 216
10.1.2 Instrumentierung 216
10.1.3 Stationäre Phasen 216
10.1.4 Detektion der chromatographischen Trennung 217
10.2 Chromatographische Theorie 218
10.3 Reinigungsstrategie für Peptide und Proteine 220
10.4 Ionenaustauschchromatographie 221
10.5 Hydroxyapatitchromatographie 223
10.6 Reve rsed phase Chromatographie 224
10.7 Hydrophobe Interaktionschromatographie 227
10.8 Affinitätschromatographie 228
10.9 Ausschlusschromatographie 231
Weiterführende Literatur 233
11 Elektrophoretische Verfahren 235
11.1 Geschichtlicher Überblick 235
11.2 Theoretische Grundlagen 237
11.3 Instrumentierung und Durchführung von
Gelelektrophoresen 240
11.3.1 Probenvorbereitung 242
11.3.2 Gelmedien für Elektrophoresen 242
11.3.3 Nachweis und Quantifizierung der getrennten
Proteine 244
11.3.4 Zonenelektrophorese 245
11.3.5 Porengradientengele 247
11.3.6 Puffersysteme 248
11.3.7 Disk Elektrophorese 248
11.3.8 Saure Nativelektrophorese 249
11.3.9 SDS Polyacrylamidgelelektrophorese 249
11.3.10 Blaue Nativ Polyacrylamidgelelektrophorese 251
11.3.11 Isoelektrische Fokussierung 251
11.4 Präparative Verfahren 255
11.4.1 Elektroelution aus Gelen 255
11.4.2 Präparative Zonenelektrophorese 256
11.4.3 Präparative isoelektrische Fokussierung 257
11.5 Trägerfreie Elektrophorese 258
11.6 Hoch auflösende zweidimensionale
Elektrophorese 258
11.6.1 Probenvorbereitung 260
11.6.2 Vorfraktionierung 260
11.6.3 Erste Dimension: IEF in IPG Streifen 261
11.6.4 Zweite Dimension: SDS Polyacrylamid
gelelektrophorese 262
11.6.5 Detektion und Identifizierung der Proteine 262
11.6.6 Differenzgelelektrophorese 263
11.7 Elektroblotting 264
11.7.1 Blotsysteme 265
11.7.2 Der Blotvorgang 266
11.7.3 Die Wahl der geeigneten Blotmembran 267
Weiterführende Literatur 268
12 Kapillarelektrophorese 269
12.1 Geschichtlicher Überblick 269
12.2 Prinzip der Kapillarelektrophorese 270
12.3 Gerätetechnik 270
12.3.1 Injektion der Proben 271
12.3.2 Detektion 272
12.4 Theoretische Grundlagen 274
12.4.1 Elektroosmotischer Fluss (EOF) 274
12.4.2 Joulesche Wärmeentwicklung 275
12.5 Trennprinzipien in der Kapillarelektrophorese 276
12.6 Kapillarzonenelektrophorese (CZE) 276
12.6.1 Elektrodispersion 278
12.6.2 Auflösung 279
12.6.3 Trennungsoptimierung 279
12.7 Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE) 281
12.8 Micellarelektrokinetische Chromatographie
(MEKC) 283
12.8.1 Theoretische Grundlagen 283
12.8.2 Chirale MEKC 286
12.9 Kapillargelelektrophorese (CGE) 287
12.10 Isoelektrische Fokussierung (CIEF) 288
12.10.1 Einschrittfokussierung 290
12.10.2 Fokussierung mit Druck /Spannungs
mobilisierung 290
12.10.3 Fokussierung mit chemischer Mobilisierung 291
12.11 Isotachophorese (ITP) 291
12.12 Spezielle Techniken 293
12.12.1 Online Probenkonzentrierung 293
12.12.2 CE MS Kopplung 294
12.12.3 Fraktionierung 295
12.13 Ausblick 296
Weiterführende Literatur 297
13 Aminosäureanalyse 299
13.1 Probenvorbereitung 300
13.1.1 Saure Hydrolyse 300
13.1.2 Alkalische Hydrolyse 301
13.1.3 Enzymatische Hydrolyse 301
13.2 Freie Aminosäuren 301
13.3 Derivatisierung 302
13.3.1 Nachsäulenderivatisierung 302
13.3.2 Vorsäulenderivatisierung 304
13.4 Datenauswertung und Beurteilung der
Analysen 308
Weiterführende Literatur 309
14 Proteinsequenzanalyse 311
14.1 A' terminale Sequenzanalyse:
Der Edman Abbau 313
14.1.1 Reaktionen des Edman Abbaus 313
14.1.2 Identifizierung der Aminosäuren 315
14.1.3 Die Qualität des Edman Abbaus:
Die repetitive Ausbeute 317
14.1.4 Instrumentierung 317
14.1.5 Probleme der Aminosäuresequenzanalyse 320
14.1.6 Stand der Technik 324
14.2 C terminale Sequenzanalyse 324
14.2.1 Chemische Abbaumethoden 324
Inhalt XIII
14.2.2 Peptidmengen und Qualität des chemischen
Abbaus 326
14.2.3 Abbau der Polypeptide mit
Carboxypeptidasen 327
Weiterführende Literatur 328
15 Massenspektrometrie 329
15.1 Matrixassistierte Laserdesorption/Ionisations
Massenspektrometrie (MALDI MS) 330
15.1.1 Ionisierungsprinzip 330
15.1.2 Massenanalyse der Ionen mit dem Flugzeit
massenspektrometer 333
15.1.3 Detektion der Ionen 337
15.1.4 Molekulargewichtsbestimmung mit MALDI 338
15.1.5 Sequenzierung von Peptiden mit MALDI 344
15.2 Elektrosprayionisations Massenspektronnetrie
(ESI MS) 351
15.2.1 Ionisierungsprinzip 352
15.2.2 ESI Quelle und Interface 355
15.2.3 Massenanalyse der Ionen mit dem Quadrupol
massenspektrometer 357
15.2.4 Massenanalyse mit der Ionenfalle 359
15.2.5 Molekulargewichtsbestimmung mit ESI MS 361
15.2.6 Strukturanalyse mit ESI MS 366
15.2.7 Sequenzierung von Peptiden mit CID 368
15.3 Relative quantitative Analyse von Proteinen
mit MS 372
Weiterführende Literatur 372
16 Protein Protein Wechselwirkungen: das
two hybrid System und andere Methoden 373
16.1 Das two hybrid System 373
16.1.1 Das Konzept des two hybrid Systems 373
16.1.2 Die Elemente des two hybrid Systems 375
16.1.3 Konstruktion des Köderproteins 376
16.1.4 Welche Köderproteine eignen sich für das
two hybrid System'? 379
16.1.5 Aktivator Fusionsprotein und cDNA
Bibliotheken 379
16.1.6 Durchführung des two hybrid Screenings 380
16.1.7 Modifizierte Anwendungen und Weiterent¬
wicklungen der two hybrid Jechno\ogie 384
16.1.8 Biochemische und funktionale Analyse
der Interaktoren 386
16.2 In v/rrw Interaktionsanalyse: GSJ pulldown 387
16.3 Ko Immunpräzipitation 388
16.4 Far Western 389
16.5 Plasmonenspektroskopie (surface plasmon
resonance) 390
16.6 Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) 392
16.6.1 Interaktions und Strukturanalyse mittels
FRET 392
16.6.2 Experimentelle Bestimmung der
FRET Effizienz 393
16.6.3 Methoden der FRET Messung 394
16.6.4 Verwendete Sonden 396
16.7 Analytische Ultrazentrifugation 397
16.7.1 Instrumentelle Grundlagen 397
XIV Inhalt
16.7.2 Grundtypen von Experimenten 398
16.7.3 Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimente 399
16.7.4 Sedimentationsgleichgewichtsexperimente 401
16.8 Was tun mit den gefundenen Interaktionen? 403
Weiterführende Literatur 404
Teil II 3D Strukturaufklärung
17 Magnetische Resonanzspektroskopie von
Biomolekülen 407
17.1 NMR Spektroskopie von Biomolekülen 407
17.1.1 Theorie der NMR Spektroskopie 408
17.1.2 Eindimensionale NMR Spektroskopie 412
17.1.3 Zweidimensionale NMR Spektroskopie 417
17.1.4 Dreidimensionale NMR Spektroskopie 423
17.1.5 Signalzuordnung 428
17.1.6 Bestimmung der Proteinstruktur 433
17.1.7 Proteinstrukturen und mehr ein Ausblick 440
17.2 EPR Spektroskopie an biologischen Systemen 441
17.2.1 Grundlagen der EPR Spektroskopie 442
17.2.2 cw EPR Spektroskopie 444
17.2.3 g Wert 444
17.2.4 Elektronenspin Kernspin Kopplung
(Hyperfeinkopplung) 444
17.2.5 g und Hyperfeinanisotropie 445
17.2.6 Elektronenspin Elektronenspin Kopplung 448
17.2.7 Gepulste EPR Experimente 449
17.2.8 Weitere Anwendungsbeispiele für EPR 455
17.2.9 Generelle Bemerkungen zur Aussagekraft
von EPR Spektren 457
17.2.10 Vergleich EPR/NMR 458
Weiterführende Literatur 459
18 Elektronenmikroskopie 461
18.1 Transmissionselektronenmikroskopie
Instrumentation 462
18.2 Präparationsverfahren 464
18.2.1 Negativkontrastierung 464
18.2.2 Bedampfung mit Schwermetallen 466
18.2.3 Einbettung in Eis 467
18.3 Abbildung von Molekülen im
Elektronenmikroskop 468
18.3.1 Auflösung eines Transmissionselektronen¬
mikroskops 468
18.3.2 Wechselwirkung des Elektronenstrahls
mit dem Objekt 469
18.3.3 Kryoelektronenmikroskopie 473
18.4 Bildanalyse, Bildverarbeitung und
3D Rekonstruktion 475
18.4.1 Digitalisierung 475
18.4.2 Fourier Transformation 475
18.4.3 Analyse der Kontrastübertragungsfunktion
und der Kristallinität des Objekts 478
18.4.4 Erhöhung des Signal zu Rausch Verhältnisses 480
18.4.5 Korrespondenzanalyse und Klassifizierung 484
18.4.6 Dreidimensionale Elektronenmikroskopie 486
18.5 Elektronentomographie individueller Objekte 490
18.5.1 Kryoelektronentomographie intakter Zellen 490
18.5.2 Identifizierung von Proteinkomplexen in
Zelltomogrammen 492
18.5.3 Perspektiven der Kryoelektronenmikroskopie 493
Weiterführende Literatur 494
19 Rasterkraftmikroskopie 495
19.1 Funktionsprinzip des Rasterkraftmikroskops 496
19.2 Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe 497
19.3 Präparationsverfahren 498
19.4 Abbilden biologischer Makromoleküle 499
19.5 Kraftspektroskopie einzelner Moleküle 501
Weiterführende Literatur 502
20 Röntgenstrukturanalyse 503
20.1 Kristallisation 503
20.2 Kristalle und Röntgenbeugung 505
20.3 Das Phasenproblem 508
20.3.1 Isomorpher Ersatz: single isomorphons
replacement (SIR) und multiple isomorphons
replacement (MIR) 508
20.3.2 Multiple anomale Dispersion (MAD) 510
20.3.3 Molekularer Ersatz (MR) 511
20.4 Modellbau und Strukturverfeinerung 511
Weiterführende Literatur 514
Teil III Spezielle Stoffgruppen
21 Analytik synthetischer Peptide 517
21.1 Prinzip der Peptidsynthese 517
21.2 Untersuchung der Reinheit synthetischer
Peptide 522
21.3 Charakterisierung und Identität synthetischer
Peptide 524
21.4 Charakterisierung der Struktur synthetischer
Peptide 528
21.5 Analytik von Peptidbibliotheken 529
Weiterführende Literatur 532
22 Kohlenhydratanalytik 533
22.1 Allgemeine stereochemische Grundlagen 534
22.1.1 Die Reihe der D Zucker 534
22.1.2 Stereochemie der D Glucose 535
22.1.3 Wichtige Monosaccharidbausteine 536
22.1.4 Die Reihe der L Zucker 537
22.1.5 Die glykosidische Bindung 538
22.2 Die Proteinglykosylierung 541
22.2.1 Aufbau der N Glykane 542
22.2.2 Der Aufbau der O Glykane 543
22.3 Glykoanalytik am intakten Glykoprotein 544
22.3.1 Ist mein Protein glykosyliert? 544
22.3.2 Charakterisierung der Glykosylierung mittels
Lectinen 547
22.3.3 Isoelektrische Fokussierung 548
22.3.4 Analyse der neutralen Monosaccharid
komponenten 549
22.3.5 Af Acetylneuraminsäure (Sialinsäure) 551
22.4 Freisetzung und Isolierung des A' Glykanpools 552
22.4.1 Enzymatische Freisetzung mittels PNGase F 552
22.4.2 Enzymatische Freisetzung mittels
Endoglykosidasen 553
22.4.3 Chemische Freisetzung mittels Hydrazinolyse 553
22.5 Isolierung einzelner A' Glykane 553
22.6 Charakterisierung der Glykane im Glykanpool 555
22.6.1 Mapping nicht derivatisierter A' Glykane 555
22.6.2 Kartierung derivatisierter A' Glykane 559
22.6.3 Kartierung mittels Kapillarelektrophorese
(CE) 562
22.7 Glykoanalytik isolierter A' Glykane
(Strukturanalyse) 564
22.7.1 Kompositionsanalyse 564
22.7.2 Methylierungsanalyse 566
22.7.3 Sequenzierung in Verbindung mit Gelfiltration 568
22.7.4 Massenspektrometrie (FAB MS, MALDI MS,
ESI MS) 569
22.7.5 'H NMR Spektroskopie 571
22.8 Genom, Proteom, Glykom 578
22.9 Schlussbetrachtung 579
Weiterführende Literatur 580
23 Lipidanalytik 581
23.1 Aufbau und Einteilung von Lipiden 581
23.2 Extraktion von Lipiden aus biologischem
Material 583
23.2.1 Flüssigphasenextraktion 583
23.2.2 Festphasenextraktion 584
23.3 Methoden der Lipidanalytik 585
23.3.1 Chromatographische Methoden 585
23.3.2 Massenspektrometrie 590
23.3.3 Immunoassays 591
23.3.4 Weitere Methoden in der Lipidanalytik 591
23.3.5 Online Kopplung verschiedener Analyse¬
systeme 593
23.4 Analytik ausgewählter Lipidklassen 595
23.4.1 Gesamtlipidextrakte 595
23.4.2 Fettsäuren 595
23.4.3 Unpolare Neutrallipide 597
23.4.4 Polare Esterlipide 599
23.4.5 Lipidhormone und intrazelluläre
Signaltransduktoren 602
23.5 Lipidvitamine 605
23.6. Lipidomanalytik 608
23.6 Ausblick 610
Weiterführende Literatur 611
24 Analytik posttransiationaler
Modifikationen: Phosphorylierung und
Acetylierung von Proteinen 613
24.1 Funktionelle Bedeutung von Phosphorylierung
und Acetylierung 613
24.1.1 Phosphorylierung 613
24.1.2 Acetylierung 614
24.2 Strategie zur Analyse der posttranslationalen
Phosphorylierung und Acetylierung von
Proteinen und Peptiden 615
Inhalt XV
24.3 Analyse posttranslational modifizierter
Proteine 617
24.3.1 Trennung und Anreicherung phosphorylierter
und acetylierter Proteine 617
24.3.2 Detektion phosphorylierter und acetylierter
Proteine mittels enzymatischer, radioaktiver,
immunchemischer und fluoreszenzbasierender
Methoden 618
24.3.3 Detektion phosphorylierter und acetylierter
Proteine mittels Massenspektrometrie 619
24.4 Analyse posttranslational modifizierter
Peptide 620
24.4.1 Trennung und Anreicherung phosphorylierter
und acetylierter Peptide 620
24.4.2 Detektion phosphorylierter und acetylierter
Peptide mittels Massenspektrometrie 622
24.5 Lokalisation und Identifizierung
posttranslational modifizierter Aminosäuren 624
24.5.1 Lokalisation phosphorylierter und acetylierter
Aminosäuren mittels Edman Sequenzierung 625
24.5.2 Lokalisation phosphorylierter und acetylierter
Aminosäuren mittels massenspektrometrischer
Fragmentionen Analyse 626
24.6 Quantitative Analyse phosphorylierter und
acetylierter Aminosäuren 628
24.7 Zukunft der Analytik posttranslationaler
Modifikationen 629
Weiterführende Literatur 630
Teil IV Nucleinsäureanalytik
25 Isolierung und Reinigung von
Nucleinsäuren 633
25.1 Reinigung und Konzentrationsbestimmung
von Nucleinsäuren 633
25.1.1 Phenolextraktion 633
25.1.2 Gelfiltration 634
25.1.3 Ethanolpräzipitation der Nucleinsäuren 635
25.1.4 Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäuren 636
25.2 Isolierung genomischer DNA 637
25.3 Isolierung niedermolekularer DNA 639
25.3.1 Isolierung von Plasmid DNA aus Bakterien 639
25.3.2 Isolierung niedermolekularer DNA aus
eukaryotischen Zellen 644
25.4 Isolierung viraler DNA 644
25.4.1 Isolierung von Phagen DNA 644
25.4.2 Isolierung von DNA aus eukaryotischen Viren 645
25.5 Isolierung einzelsträngiger DNA 646
25.5.1 Isolierung von Ml3 DNA 646
25.5.2 Trennung von einzel und doppelsträngiger
DNA 647
25.6 Isolierung von RNA 647
25.6.1 Isolierung von cytoplasmatischer RNA 648
25.6.2 Isolierung von poly(A)+ RNA 649
25.7 Isolierung von Nucleinsäuren unter
Verwendung von magnetischen Partikeln 650
Weiterführende Literatur 651
XVI Inhalt
26 Aufarbeitung von Nucleinsäuren 653
26.1 Restriktionsanalyse 653
26.1.1 Prinzip der Restriktionsanalyse 653
26.1.2 Historischer Überblick 654
26.1.3 Restriktionsenzyme 654
26.1.4 Der Restriktionsansatz und seine
Anwendungen 657
26.2 Elektrophorese 663
26.2.1 Gelelektrophorese von DNA 664
26.2.2 Gelelektrophorese von RNA 670
26.2.3 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) 672
26.2.4 Zweidimensionale Gelelektrophorese 675
26.2.5 Kapillargelelektrophorese 678
26.3 Färbemethoden 679
26.3.1 Fluoreszenzfarbstoffe 679
26.3.2 Silberfärbung 681
26.4 Nucleinsäureblotting 681
26.4.1 Blottingverfahren 681
26.4.2 Wahl der Membranen 682
26.4.3 Southern Blotting 683
26.4.4 Northern Blotting 685
26.4.5 Dot und Slot Blotting 686
26.4.6 Kolonie und Plaquehybridisierungen 687
26.5 Fragmentisolierung 688
26.5.1 Reinigung über Glas beads 688
26.5.2 Reinigung über Gelfiltrations oder reversed
p/wse Säulen 689
26.5.3 Elektroelution 689
26.5.4 Andere Methoden 690
26.6 LC MS von Oligonucleotiden 690
26.6.1 Prinzip der Synthese von Oligonucleotiden 690
26.6.2 Untersuchung der Reinheit und
Charakterisierung von Oligonucleotiden 693
26.6.3 Massenspektrometrische Untersuchung von
Oligonucleotiden 694
26.6.4 IP RP HPLC MS Untersuchung eines
Phosphorothioatoligonucleotids 696
Weiterführende Literatur 699
27 Hybridisierung und Nachweistechniken 701
27.1 Grundlagen der Hybridisierung 702
27.1.1 Prinzip und Durchführung der Hybridisierung 703
27.1.2 Spezifität der Hybridisierung und Stringenz 704
27.1.3 Hybridisierungsformate 705
27.2 Sonden zur Nucleinsäureanalytik 713
27.2.1 DNA Sonden 714
27.2.2 RNA Sonden 715
27.2.3 PNA Sonden 716
27.2.4 LNA Sonden 717
27.3 Markierungsverfahren 717
27.3.1 Markierungspositionen 719
27.3.2 Enzymatische Markierungsreaktionen 720
27.3.3 Photochemische Markierungsreaktionen 721
27.3.4 Chemische Markierungsreaktionen 722
27.4 Nachweissysteme 723
27.4.1 Färbemethoden 723
27.4.2 Radioaktive Systeme 723
27.4.3 Nichtradioaktive Systeme 725
j
I
27.5 Amplifikationssysteme 736 I
27.5.1 Targetamplifikation 737 j
27.5.2 Targetspezifische Signalamplifikation 738 ;
27.5.3 Signalamplifikation 738
Weiterführende Literatur 740
28 Polymerasekettenreaktion 743
28.1 Möglichkeiten der PCR 744
28.2 Grundlagen 746
28.2.1 Instrumentierung 746
28.2.2 Amplifikation von DNA 746
28.2.3 Amplifikation von RNA (RT PCR) 749
28.2.4 Optimierung der Reaktion 752
28.2.5 Quantitative PCR 753
28.3 Spezielle PCR Techniken 755
28.3.1 NestedVCR 755
28.3.2 Asymmetrische PCR 756
28.3.3 Einsatz von degenerierten Primern 756 :
28.3.4 Multiplex PCR 757 ;
28.3.5 Cycle sequencing 757
28.3.6 In vifro Mutagenese 758
28.3.7 Homogene PCR Detektionsverfahren 760
28.3.8 Quantitative Amplifikationsverfahren 760
28.3.9 In «ta PCR 760
28.3.10 Weitere Verfahren 761
28.4 Kontaminationsproblematik 761
28.4.1 Vermeidung von Kontaminationen 762
28.4.2 Dekontamination 763
28.5 Anwendungen 764
28.5.1 Nachweis von Infektionskrankheiten 764
28.5.2 Nachweis von genetischen Defekten 765
28.5.3 Humangenomprojekt 768
28.6 Alternative Verfahren der Amplifikation 769
28.6.1 Nucleic acid sequence based amplification
(NASBA) 769
28.6.1.1 Transcription mediated amplification (TMA) 771
28.6.2 Strand displacement amplification (SDA) 771
28.6.3 Ligase chain reaction (LCR) 772
28.6.4 Qß Amplifikation (Qß amplification) 113
26.6.5 Branched DNA amplification (bDNA) 774
28.7 Ausblick 774
Weiterführende Literatur 775
29 DNA Sequenzierung 777
29.1 Gelgestützte DNA Sequenzierungsverfahren 781
29.1.1 Sequenzierung nach Sanger: das Didesoxy
verfahren 781
29.1.2 Markierungstechniken und Nachweisverfahren 789
29.1.3 Chemische Spaltung nach Maxam und Gilbert 794
29.2 Gelfreie DNA Sequenzierungsmethoden 800
Weiterführende Literatur 803
30 Gezielte Genmodifikation in der Maus 805
30.1 Strategien zur gezielten Genmodifikation 806
30.2 Vom DNA Konstrukt zur Maus 807
30.2.1 Mikroinjektion von ES Zellen in Blastocysten,
Morulaaggregation von ES Zellen, ES Mäuse 807
30.2.2 Pronucleusinjektion von DNA, virale Infektion 810
30.3 Das Cre/loxP Rekombinasesystem als
Beispiel für einen Genschalter 812
30.4 Strategien zur gezielten Genmodifikation
unter Verwendung von Genschaltern 813
30.5 Konditionale Mutagenese 815
Weiterführende Literatur 819
31 Analyse der genomischen
DNA Methylierung 821
31.1 Überblick über die Detektionsmethoden
der DNA Methylierung 822
31.2 Methylierungsanalyse mit der Bisulfittechnik 823
31.2.1 Amplifikation und Sequenzierung von
bisulfitbehandelter DNA 824
31.2.2 Restriktionsanalyse nach Bisulfit PCR 825
31.2.3 Methylierungsspezifische PCR 826
31.3 Methylierungsanalyse mit Hydrazin und
Permanganatmodifikationen 827
31.4 Analyse der DNA mit methylierungs
speziflschen Restriktionsenzymen 828
31.5 Methylierungsanalyse durch methylcytosin
bindende Proteine 830
31.6 Methylierungsanalyse durch DNA Hydrolyse
und nearest neighbor Assays 831
31.7 Ausblick 832
Weiterführende Literatur 832
32 Protein Nucleinsäure Wechselwirkungen 833
32.1 DNA Protein Wechselwirkungen 833
32.1.1 Grundlagen der DNA Protein Erkennung:
helikale Doppelstränge 833
32.1.2 DNA Krümmung 834
32.1.3 DNA Topologie 836
32.2 DNA Bindungsmotive 837
32.3 Spezielle Analysemethoden 838
32.3.1 Filterbindung 838
32.3.2 Gelelektrophorese 839
32.3.3 Bestimmung von Dissoziationskonstanten 842
32.3.4 Analyse der Dynamik von DNA Protein
Komplexen 843
32.4 DN A footprint Analysen 845
32.4.1 Markierung der DNA 847
32.4.2 Primer ?.öe«.s/oM Analyse für DNA 847
32.4.3 Hydrolyse Methoden 848
32.4.4 Chemische Reagenzien für Modifikation
von DNA Protein Komplexen 850
32.4.5 Interferenzbedingungen 853
32.4.6 Chemische Nucleasen 854
32.5 Physikalische Analysen 855
32.5.1 Fluoreszenz Methoden 855
32.5.2 Fluorophore und Markierungsverfahren 856
32.5.3 Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) 856
32.5.4 Molekulare Lichtsonden (molecular beacons) 857
32.5.5 Surface plasmon resonance (SPR) 857
32.5.6 Scanning force microscopy (SFM) 859
32.5.7 Optical tweezer 859
32.5.8 Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) 859
32.6 RNA Protein Wechselwirkungen 860
Inhalt XVII
32.6.1 Funktionsvielfalt der RNA 860
32.6.2 RNA Sekundärstrukturparameter und
ungewöhnliche Basenpaarungen 861
32.6.3 Dynamik der RNA Protein Erkennung 861
32.7 Charakteristische RNA Bindungsmotive 863
32.8 Spezielle Methoden zur Analyse von RNA
Protein Komplexen 865
32.8.1 Limitierte enzymatische Hydrolyse 865
32.8.2 Markierungsmethoden 865
32.8.3 Primer extension von RNA 866
32.8.4 Gebräuchliche RNasen 867
32.8.5 Chemische Modifikation von RNA Protein
Komplexen 868
32.8.6 Chemische Quervernetzung 870
32.8.7 Einbau photoreaktiver Nucleotide 871
32.9 Genetische Methoden 872
32.9.1 Tri hybrid Methode 872
32.9.2 Aptamere und das Selex Verfahren 873
32.9.3 Gezielte Mutationen in Bindedomänen 874
Weiterführende Literatur 875
Teil V Systematische Funktions¬
analytik
33 Sequenzanalyse 879
33.1 Sequenzanalyse und Bioinformatik 879
33.2 Datenbanken 881
33.2.1 Datenabruf 881
33.3 Webdienste 885
33.4 Analyse der Sequenzzusammensetzung 885
33.5 Muster in Sequenzen 886
33.5.1 Sequenzsignale: funktionale Motive 887
33.5.2 Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren 888
33.5.3 Identifizierung codierender Bereiche in DNA 888
33.5.4 Proteinlokalisierung 889
33.5.5 Sekundärstruktur 890
33.6 Homologie 890
33.6.1 Identität, Ähnlichkeit und Homologie 890
33.6.2 Alignment 892
33.6.3 Optimales Alignment 893
33.6.4 Alignment für schnelle Datenbanksuchen:
BLAST 895
33.6.5 Profilbasierte Datenbanksuche: PSI BLAST 897
33.7 Multiples Alignment und Konsensussequenzen 897
33.8 Sequenz und Struktur 898
33.9 Ausblicke 899
Weiterführende Literatur 900
34 Analyse von Promotorstärke und aktiver
RNA Synthese 971
34.1 Methoden zur Analyse von RNA Transkripten 901
34.1.1 Überblick 901
34.1.2 Nuclease Sl Analyse von RNA 902
34.1.3 Ribonucleaseprotektionsassay (RPA) 905
34.1.4 Primerverlängerung (Primer ettension) 908
34.1.5 Northern Blot, Dot und Slot Blot 909
XVIII Inhalt
34.1.6 Quantitative Polymerasekettenreaktion
(real time PCR) 911
34.2 Analyse der RNA Syntheserate in vivo
(nuclear run on Ass y) 912
34.2.1 Zellaufschluss 912
34.2.2 Die nuclear ran on Transkription und
Detektion der Transkripte 913
34.3 Die in vftro Transkription Monierter Gene in
Extrakten und Proteinfraktionen 913
34.3.1 Komponenten des in vi'fro Transkriptions
ansatzes 913
34.3.2 Herstellung transkriptionsaktiver Extrakte
und Proteinfraktionen 914
34.3.3 Promotorspezifische Matrizen DNA und
Detektion der in vzVro Transkripte 914
34.4 Die in vi'vo Analyse Monierter Promotoren in
Säugerzellen 917
34.4.1 Plasmidvektoren für die Analyse von
czs aktiven Elementen in Säugerzellen 917
34.4.2 Einschleusen von Fremd DNA in Säugerzellen 919
34.4.3 Die Charakterisierung der in v/vo Transkripte
der Monierten Promotoren 920
Weiterführende Literatur 922
35 Fluoreszenzmarkierte DNA Hybridisierung
zur Genomanalyse in der molekularen
Cytogenetik 923
35.1 Methoden der fluoreszenzmarkierten DNA
Hybridisierung 924
35.1.1 Markierungsstrategie 924
35.1.2 DNA Sonden für FISH und CGH 924
35.1.3 Markierung der DNA Sonden 925
35.1.4 In .s/ta Hybridisierung 926
35.1.5 Fluoreszenzauswertung der Hybridisierungs
signale 927
35.2 Anwendungen: FISH und CGH 928
35.2.1 Analyse genomischer DNA durch FISH 928
35.2.2. Vergleichende genomische Hybridisierung
(CGH) 930
Weiterführende Literatur 933
36 Physikalische und genetische Gen
kartierung 935
36.1 Genetische Kartierung: Lokalisierung von
Loci im Genom 935
36.1.1 Rekombination 935
36.1.2 Genetische Marker 937
36.1.3 Kopplungsanalyse die Erstellung genetischer
Karten 939
36.1.4 Die genetische Karte des menschlichen
Genoms 941
36.1.5 Genetische Kartierung von Krankheitsgenen 942
36.2 Physikalische Kartierung 943
36.2.1 Restriktionskartierung ganzer Genome 943
36.2.2 Kartierung mittels rekombinanter Klone 945
36.2.3 Erstellung der physikalischen Karte 947
36.2.4 Isolierung und Identifizierung von Genen 949
36.2.5 Transkriptkarten des menschlichen Genoms 951
36.2.6 Gen und vererbbare Krankheit die
Mutationssuche 952
36.3 Integration der Genkarten 953
36.4 Das Humangenomprojekt 954
Weiterführende Literatur 955
37 Differenzielle Genaktivität 957
37.1 Grundprinzip des differential display 957
37.2 Experimentelle Durchführung des differential
display 958
37.2.1 RNA Isolierung 958
37.2.2 Synthese der cDNA 958
37.2.3 Amplifikation durch die erste PCR 959
37.2.4 Modifikationen der PCR und der Nachweis¬
reaktion 960
37.2.5 Polyacrylamidgelelektrophorese 961
37.2.6 Aufreinigung von PCR Produkten 961
37.2.7 Northern Blot Analyse 962
37.2.8 Klonierung der cDNAs 962
37.2.9 Alternative zur Northern Blot Analyse:
Microarray Analysen 963
37.3 Leistungsfähigkeit des differential display 963
37.3.1 Abgeleitete Methoden 963
37.3.2 Methodenkombinationen mit differential
display 963
37.3.3 Differential display und Microarray Analyse 964
37.4 Einsatzmöglichkeiten des differential display 964
Weiterführende Literatur 965
38 DNA Microarray Technologie 967
38.1 RNA Analysen 968
38.1.1 Transcriptional profiling 968
38.1.2 RNA Reifung 969
38.1.3 RNA Struktur und Funktionalität 969
38.2 DNA Analysen 969
38.2.1 DNA Kartierung 969
38.2.2 Comparative genomic Hybridisation (CGH) 970
38.2.3 Protein DNA Interaktionen 971
38.2.4 Genotypisierung 972
38.2.5 Epigenetische Studien 973
38.2.6 DNA Sequenzierung 973
38.3 Molekülsynthese 974
38.3.1 DNA Synthese 974
38.3.2 Herstellung von RNAi 975
38.3.3 Chipgebundene Proteinexpression 975
38.4 Neue Ansätze 976
38.4.1 Eine universelle Chip Plattform 976
38.4.2 Strukturanalysen 976
38.4.3 Jenseits von Nucleinsäuren 977
Weiterführende Literatur 977
39 Oligonucleotide als zellbiologische
Werkzeuge 979
39.1 AnZ/se/zse Oligonucleotide 980
39.1.1 Wirkweisen von an/we/we Oligonucleotiden 981
39.1.2 Triplexbildende Oligonucleotide 982
39.1.3 Modifikationen von Oligonueleotiden zur
Steigerung der Nucleasestabilität 982
39.1.4 Einsatz von antisense Oligonucleoüden in
Zellkultur und in Tiermodellen 984
39.1.5 Antisense Oligonucleotidt als neue
Arzneimittel 985
39.2 Ribozyme 986
39.2.1 Entdeckung und Klassifikation von
Ribozymen 986
39.2.2 Anwendungen von Ribozymen 986
39.3 RNA Interferenz 987
39.3.1 Grundlagen der RNA Interferenz 987
39.3.2 RNA Interferenz durch Expressionsvektoren 988
39.3.3 Anwendungen der RNA Interferenz 989
39.4 Aptamere: Hoch affine RNA und DNA
Oligonucleotide 990
39.4.1 Selektion von Aptameren 990
39.3.2 Anwendungen von Aptameren 992
39.5 Ausblick 992
Weiterführende Literatur 993
40 Proteomanalyse 995
40.1 Definition der Ausgangsbedingungen und
der Fragestellung, Projektplanung 998
40.2 Probenvorbereitung 999
40.3 Die quantitative Analyse des Proteoms 1000
40.3.1 Klassische gelbasierte Proteomanalyse 1001
40.3.2 Zweidimensionale differenzielle Gel¬
elektrophorese (2D DIGE) 1005
40.3.3 Nicht gelbasierte Proteomanalyse 1006
40.4 Bioinformatik 1014
40.5 Diskussion und Ausblick 1014
Weiterführende Literatur 1016
41 Metabolomics und Peptidomics 1017
41.1 Systembiologie und Metabolomics 1018
41.2 Technologische Plattformen für Metabolomics 1019
41.3 Metabolomisches profiling 1021
41.4 Peptidomics 1022
41.5 Metabolomics knowledge mining 1023
41.6 Data mining 1024
41.7 Anwendungsfelder 1025
41.8 Ausblick 1026
Weiterführende Literatur 1026
42 Interactomics Systematische Protein
Protein Wechselwirkungen 1027
42.1 Protein Microarrays 1027
42.1.1 Sensitivität durch Miniaturisierung — ambient
analyte assay 1028
42.1.2 Von DNA zu Protein Microarrays 1030
42.1.3 Anwendungen von Protein Microarrays 1031
Weiterführende Literatur 1033
Inhalt XIX
43 Toponomanalyse 1035
43.1 Lichtmikroskopische Methoden im
Hochdurchsatz 1035
43.2 Antikörperbasierte Toponomanalyse mit
Multi Epitop Ligand Kartierung (MELK) 1036
43.2.1 Konzept des Proteintoponoms 1037
43.2.2 Imaging cycler robots: Grundlage einer
Toponomlesetechnologie 1038
43.2.3 Ein Beispiel: Spezifität und Selektivität
des Zelloberflächentoponoms 1039
43.2.4 Methoden der Toponomanalyse 1040
43.2.5 Zusammenfassung und Ausblick 1047
43.3 Abbildende Massenspektrometrie 1048
43.3.1 Analytische Mikrosonden 1048
43.3.2 Images: Massenspektrometrische Rasterbilder 1049
43.3.3 SMALDI MS: Das Matrixdilemma 1049
43.3.4 SIMS und ME SIMS imaging: Die
Erweiterung des Massenbereichs 1050
43.3.5 Auflösung versus Empfindlichkeit 1050
43.3.6 Organe und Gewebe: MALDI imaging mit
niedriger Auflösung 1051
43.3.7 Biologische Zellen und Zellorganellen:
MS imaging mit hoher Auflösung 1051
43.3.8 Identifizierung und Charakterisierung 1052
Weiterführende Literatur 1052
44 Systembiologie 1055
44.1 Ziele der Systembiologie 1055
44.1.1 Definition 1055
44.2 Methodische Ansätze 1056
44.2.1 Modellaufbau 1056
44.2.2 Induktiver versus deduktiver Lösungsansatz 1056
44.2.3 Mathematische Werkzeuge 1057
44.3 Beispiele für systembiologische Modelle 1058
44.3.1 Studien in der pharmakologischen Forschung 1058
44.3.2 Signaltransduktion JAK/STAT 1060
44.3.3 Signaltransduktion EGF Rezeptor/MAPK 1061
44.4 Hürden und Perspektiven für die System¬
biologie 1062
44.5 Internationale Forschungsnetzwerke 1062
Weiterführende Literatur 1063
Anhang
Anhang 1: Strahlenschutz im Labor 1067
Anhang 2: Aminosäuren und posttranslationale
Modifikationen 1093
Anhang 3: Symbole und Abkürzungen 1095
Index 1101 |
| adam_txt |
Inhaltsübersicht
1 Bioanalytik eine eigenständige Wissenschaft 1
Teil I Proteinanalytik
2 Proteinreinigung 13
3 Proteinbestimmungen 35
4 Enzymatische Aktivitätstests 47
5 Immunologische Techniken 61
6 Chemische Modifikation von Proteinen und
Proteinkomplexen 103
7 Spektroskopie 129
8 Lichtmikroskopische Verfahren Imaging 175
9 Spaltung von Proteinen 201
10 Chromatographische Trennmethoden 215
11 Elektrophoretische Verfahren 235
12 Kapillarelektrophorese 269
13 Aminosäureanalyse 299
14 Proteinsequenzanalyse 311
15 Massenspektrometrie 329
16 Protein Protein Wechselwirkungen:
das two hvbrid System und andere Methoden 373
Teil II 3D Strukturaufklärung
17 Magnetische Resonanzspektroskopie von
Biomolekülen 407
18 Elektronenmikroskopie 461
19 Rasterkraftmikroskopie 495
20 Röntgenstrukturanalyse 503
Teil III Spezielle Stoffgruppen
21 Analytik synthetischer Peptide 517
22 Kohlenhydratanalytik 533
23 Lipidanalytik 581
24 Analytik posttranslationaler Modifikationen:
Phosphorylierung und Acetylierung von Proteinen 613
Teil IV Nucleinsäureanalytik
25 Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren 633
26 Aufarbeitung von Nucleinsäuren 653
27 Hybridisierung und Nachweistechniken 701
28 Polymerasekettenreaktion 743
29 DNA Sequenzierung 777
30 Gezielte Genmodifikation in der Maus 805
31 Analyse der genomischen DNA Methylierung 821
32 Protein Nucleinsäure Wechselwirkungen 833
Teil V Systematische Funktions¬
analytik
33 Sequenzanalyse 879
34 Analyse von Promotorstärke und aktiver
RNA Synthese 971
35 Fluoreszenzmarkierte DNA Hybridisierung zur
Genomanalyse in der molekularen Cytogenetik 923
36 Physikalische und genetische Genkartierung 935
37 Differenzielle Genaktivität 957
38 DNA Microarray Technologie 967
39 Oligonucleotide als zellbiologische Werkzeuge 979
40 Proteomanalyse 995
41 Metabolomics und Peptidomics 1017
42 Interactomics Systematische Protein Protein
Wechselwirkungen 1027
43 Toponomanalyse 1035
44 Systembiologie 1055
Anhang
Anhang 1: Strahlenschutz im Labor 1067
Anhang 2: Aminosäuren und posttranslationale
Modifikationen 1093
Anhang 3: Symbole und Abkürzungen 1095
Index 1101
Inhalt
Vorwort V
Autoren XXI
1 Bioanalytik eine eigenständige Wissenschaft 1
1.1 Paradigmenwechsel in der Biochemie:
Von der Proteinchemie zur Systembiologie 2
1.1.1 Klassische Strategie 2
1.1.2 Holistische Strategie 2
1.2 Methoden begründen Fortschritt 3
1.2.1 Proteinanalytik 5
1.2.2 Molekularbiologie 6
1.2.3 Bioinformatik 7
1.2.4 Funktionsanalyse 7
Teil I Proteinanalytik
2 Proteinreinigung 13
2.1 Eigenschaften von Proteinen 13
2.2 Proteinlokalisation und Reinigungsstrategie 16
2.3 Homogenisierung und Zellaufschluss 17
2.4 Die Fällung 20
2.5 Zentrifugation 21
2.5.1 Grundlagen 22
2.5.2 Zentrifugationstechniken 24
2.6 Abtrennung von Salzen oder hydrophilen
Verunreinigungen 26
2.7 Konzentrierung 28
2.8 Detergenzien und ihre Entfernung 29
2.8.1 Eigenschaften von Detergenzien 29
2.8.2 Entfernen von Detergenzien 32
2.9 Probenvorbereitung für die Proteomanalyse 33
Weiterführende Literatur 33
3 Proteinbestimmungen 35
3.1 Quantitative Bestimmung durch Färbetests 37
3.1.1 Biuret Assay 38
3.1.2 Lowry Assay 38
3.1.3 Bicinchoninsäure Assay (BCA Assay) 39
3.1.4 Bradford Assay 40
3.2 Spektroskopische Methoden 41
3.2.1 Messungen im UV Bereich 41
3.2.2 Fluoreszenzmethode 43
3.3 Radioaktive Markierung von Peptiden
und Proteinen 44
3.3.1 Iodierungen 46
Weiterführende Literatur 46
XII Inhalt
6.2.2 Untersuchungen an überexprimierten oder
mutierten Proteinen 116
6.3 Protein cross linking zur Analyse von
Proteinwechselwirkungen 117
6.3.1 Bifunktionelle Reagenzien 118
6.3.2 Photoaffinitätsmarkierung 118
Weiterführende Literatur 127
7 Spektroskopie 129
7.1 Physikalische Prinzipien und Messtechniken 130
7.1.1 Physikalische Grundlagen optischer
spektroskopischer Messmethoden 130
7.1.2 Wechselwirkung Licht Materie 130
7.1.3 Absorptionsmessungen 138
7.1.4 Photometer 141
7.1.5 Kinetische spektroskopische Untersuchungen 142
7.2 UV/VIS/NIR Spektroskopie 144
7.2.1 Grundlagen 144
7.2.2 Chromoproteine 145
7.3 IR Spektroskopie 152
7.3.1 Grundlagen 152
7.3.2 Molekiilschwingungen 153
7.3.3 Messtechniken 155
7.3.4 Infrarotspektroskopie von Proteinen 158
7.4 Raman Spektroskopie 160
7.4.1 Grundlagen 160
7.4.2 Raman Experimente 161
7.4.3 Resonanz Raman Spektroskopie 163
7.5 Fluoreszenzspektroskopie 164
7.5.1 Grundlagen 164
7.5.2 Fluoreszenzspektren als Emissionsspektren
und als Aktionsspektren 166
7.5.3 Fluoreszenzuntersuchungen mit intrinsischen
und extrinsischen Fluorophoren 168
7.6 Methoden mit polarisiertem Licht 169
7.6.1 Lineardichroismus 169
7.6.2 Optische Rotationsdispersion und
Circulardichroismus 172
Weiterführende Literatur 174
8 Lichtmikroskopische Verfahren Imaging 175
8.1 Wegbereiter der Mikroskopie von einfachen
Linsen zu hoch auflösenden Mikroskopen 175
8.2 Moderne Anwendungsbereiche 176
8.3 Physikalische Grundlagen 177
8.4 Nachweismethoden 183
8.5 Präparationsmethoden 190
8.6 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie 193
8.7 Live cell imaging 194
Weiterführende Literatur 199
Internetseiten 200
9 Spaltung von Proteinen 201
9.1 Proteolytische Enzyme 201
9.2 Strategie 202
9.3 Denaturierung 203
9.4 Spaltung von Disulfidbrücken und Alkylierung 203
9.5 Enzymatische Fragmentierung 205
9.5.1 Proteasen 206
9.5.2 Proteolysebedingungen 210
9.6 Chemische Fragmentierung 211
9.7 Ausblick 214
Weiterführende Literatur 214
10 Chromatographische Trennmethoden 215
10.1 Prinzip der Chromatographie 215
10.1.1 Grundbegriffe 216
10.1.2 Instrumentierung 216
10.1.3 Stationäre Phasen 216
10.1.4 Detektion der chromatographischen Trennung 217
10.2 Chromatographische Theorie 218
10.3 Reinigungsstrategie für Peptide und Proteine 220
10.4 Ionenaustauschchromatographie 221
10.5 Hydroxyapatitchromatographie 223
10.6 Reve rsed phase Chromatographie 224
10.7 Hydrophobe Interaktionschromatographie 227
10.8 Affinitätschromatographie 228
10.9 Ausschlusschromatographie 231
Weiterführende Literatur 233
11 Elektrophoretische Verfahren 235
11.1 Geschichtlicher Überblick 235
11.2 Theoretische Grundlagen 237
11.3 Instrumentierung und Durchführung von
Gelelektrophoresen 240
11.3.1 Probenvorbereitung 242
11.3.2 Gelmedien für Elektrophoresen 242
11.3.3 Nachweis und Quantifizierung der getrennten
Proteine 244
11.3.4 Zonenelektrophorese 245
11.3.5 Porengradientengele 247
11.3.6 Puffersysteme 248
11.3.7 Disk Elektrophorese 248
11.3.8 Saure Nativelektrophorese 249
11.3.9 SDS Polyacrylamidgelelektrophorese 249
11.3.10 Blaue Nativ Polyacrylamidgelelektrophorese 251
11.3.11 Isoelektrische Fokussierung 251
11.4 Präparative Verfahren 255
11.4.1 Elektroelution aus Gelen 255
11.4.2 Präparative Zonenelektrophorese 256
11.4.3 Präparative isoelektrische Fokussierung 257
11.5 Trägerfreie Elektrophorese 258
11.6 Hoch auflösende zweidimensionale
Elektrophorese 258
11.6.1 Probenvorbereitung 260
11.6.2 Vorfraktionierung 260
11.6.3 Erste Dimension: IEF in IPG Streifen 261
11.6.4 Zweite Dimension: SDS Polyacrylamid
gelelektrophorese 262
11.6.5 Detektion und Identifizierung der Proteine 262
11.6.6 Differenzgelelektrophorese 263
11.7 Elektroblotting 264
11.7.1 Blotsysteme 265
11.7.2 Der Blotvorgang 266
11.7.3 Die Wahl der geeigneten Blotmembran 267
Weiterführende Literatur 268
12 Kapillarelektrophorese 269
12.1 Geschichtlicher Überblick 269
12.2 Prinzip der Kapillarelektrophorese 270
12.3 Gerätetechnik 270
12.3.1 Injektion der Proben 271
12.3.2 Detektion 272
12.4 Theoretische Grundlagen 274
12.4.1 Elektroosmotischer Fluss (EOF) 274
12.4.2 Joulesche Wärmeentwicklung 275
12.5 Trennprinzipien in der Kapillarelektrophorese 276
12.6 Kapillarzonenelektrophorese (CZE) 276
12.6.1 Elektrodispersion 278
12.6.2 Auflösung 279
12.6.3 Trennungsoptimierung 279
12.7 Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE) 281
12.8 Micellarelektrokinetische Chromatographie
(MEKC) 283
12.8.1 Theoretische Grundlagen 283
12.8.2 Chirale MEKC 286
12.9 Kapillargelelektrophorese (CGE) 287
12.10 Isoelektrische Fokussierung (CIEF) 288
12.10.1 Einschrittfokussierung 290
12.10.2 Fokussierung mit Druck /Spannungs
mobilisierung 290
12.10.3 Fokussierung mit chemischer Mobilisierung 291
12.11 Isotachophorese (ITP) 291
12.12 Spezielle Techniken 293
12.12.1 Online Probenkonzentrierung 293
12.12.2 CE MS Kopplung 294
12.12.3 Fraktionierung 295
12.13 Ausblick 296
Weiterführende Literatur 297
13 Aminosäureanalyse 299
13.1 Probenvorbereitung 300
13.1.1 Saure Hydrolyse 300
13.1.2 Alkalische Hydrolyse 301
13.1.3 Enzymatische Hydrolyse 301
13.2 Freie Aminosäuren 301
13.3 Derivatisierung 302
13.3.1 Nachsäulenderivatisierung 302
13.3.2 Vorsäulenderivatisierung 304
13.4 Datenauswertung und Beurteilung der
Analysen 308
Weiterführende Literatur 309
14 Proteinsequenzanalyse 311
14.1 A' terminale Sequenzanalyse:
Der Edman Abbau 313
14.1.1 Reaktionen des Edman Abbaus 313
14.1.2 Identifizierung der Aminosäuren 315
14.1.3 Die Qualität des Edman Abbaus:
Die repetitive Ausbeute 317
14.1.4 Instrumentierung 317
14.1.5 Probleme der Aminosäuresequenzanalyse 320
14.1.6 Stand der Technik 324
14.2 C terminale Sequenzanalyse 324
14.2.1 Chemische Abbaumethoden 324
Inhalt XIII
14.2.2 Peptidmengen und Qualität des chemischen
Abbaus 326
14.2.3 Abbau der Polypeptide mit
Carboxypeptidasen 327
Weiterführende Literatur 328
15 Massenspektrometrie 329
15.1 Matrixassistierte Laserdesorption/Ionisations
Massenspektrometrie (MALDI MS) 330
15.1.1 Ionisierungsprinzip 330
15.1.2 Massenanalyse der Ionen mit dem Flugzeit
massenspektrometer 333
15.1.3 Detektion der Ionen 337
15.1.4 Molekulargewichtsbestimmung mit MALDI 338
15.1.5 Sequenzierung von Peptiden mit MALDI 344
15.2 Elektrosprayionisations Massenspektronnetrie
(ESI MS) 351
15.2.1 Ionisierungsprinzip 352
15.2.2 ESI Quelle und Interface 355
15.2.3 Massenanalyse der Ionen mit dem Quadrupol
massenspektrometer 357
15.2.4 Massenanalyse mit der Ionenfalle 359
15.2.5 Molekulargewichtsbestimmung mit ESI MS 361
15.2.6 Strukturanalyse mit ESI MS 366
15.2.7 Sequenzierung von Peptiden mit CID 368
15.3 Relative quantitative Analyse von Proteinen
mit MS 372
Weiterführende Literatur 372
16 Protein Protein Wechselwirkungen: das
two hybrid System und andere Methoden 373
16.1 Das two hybrid System 373
16.1.1 Das Konzept des two hybrid Systems 373
16.1.2 Die Elemente des two hybrid Systems 375
16.1.3 Konstruktion des Köderproteins 376
16.1.4 Welche Köderproteine eignen sich für das
two hybrid System'? 379
16.1.5 Aktivator Fusionsprotein und cDNA
Bibliotheken 379
16.1.6 Durchführung des two hybrid Screenings 380
16.1.7 Modifizierte Anwendungen und Weiterent¬
wicklungen der two hybrid Jechno\ogie 384
16.1.8 Biochemische und funktionale Analyse
der Interaktoren 386
16.2 In v/rrw Interaktionsanalyse: GSJ pulldown 387
16.3 Ko Immunpräzipitation 388
16.4 Far Western 389
16.5 Plasmonenspektroskopie (surface plasmon
resonance) 390
16.6 Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) 392
16.6.1 Interaktions und Strukturanalyse mittels
FRET 392
16.6.2 Experimentelle Bestimmung der
FRET Effizienz 393
16.6.3 Methoden der FRET Messung 394
16.6.4 Verwendete Sonden 396
16.7 Analytische Ultrazentrifugation 397
16.7.1 Instrumentelle Grundlagen 397
XIV Inhalt
16.7.2 Grundtypen von Experimenten 398
16.7.3 Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimente 399
16.7.4 Sedimentationsgleichgewichtsexperimente 401
16.8 Was tun mit den gefundenen Interaktionen? 403
Weiterführende Literatur 404
Teil II 3D Strukturaufklärung
17 Magnetische Resonanzspektroskopie von
Biomolekülen 407
17.1 NMR Spektroskopie von Biomolekülen 407
17.1.1 Theorie der NMR Spektroskopie 408
17.1.2 Eindimensionale NMR Spektroskopie 412
17.1.3 Zweidimensionale NMR Spektroskopie 417
17.1.4 Dreidimensionale NMR Spektroskopie 423
17.1.5 Signalzuordnung 428
17.1.6 Bestimmung der Proteinstruktur 433
17.1.7 Proteinstrukturen und mehr ein Ausblick 440
17.2 EPR Spektroskopie an biologischen Systemen 441
17.2.1 Grundlagen der EPR Spektroskopie 442
17.2.2 cw EPR Spektroskopie 444
17.2.3 g Wert 444
17.2.4 Elektronenspin Kernspin Kopplung
(Hyperfeinkopplung) 444
17.2.5 g und Hyperfeinanisotropie 445
17.2.6 Elektronenspin Elektronenspin Kopplung 448
17.2.7 Gepulste EPR Experimente 449
17.2.8 Weitere Anwendungsbeispiele für EPR 455
17.2.9 Generelle Bemerkungen zur Aussagekraft
von EPR Spektren 457
17.2.10 Vergleich EPR/NMR 458
Weiterführende Literatur 459
18 Elektronenmikroskopie 461
18.1 Transmissionselektronenmikroskopie
Instrumentation 462
18.2 Präparationsverfahren 464
18.2.1 Negativkontrastierung 464
18.2.2 Bedampfung mit Schwermetallen 466
18.2.3 Einbettung in Eis 467
18.3 Abbildung von Molekülen im
Elektronenmikroskop 468
18.3.1 Auflösung eines Transmissionselektronen¬
mikroskops 468
18.3.2 Wechselwirkung des Elektronenstrahls
mit dem Objekt 469
18.3.3 Kryoelektronenmikroskopie 473
18.4 Bildanalyse, Bildverarbeitung und
3D Rekonstruktion 475
18.4.1 Digitalisierung 475
18.4.2 Fourier Transformation 475
18.4.3 Analyse der Kontrastübertragungsfunktion
und der Kristallinität des Objekts 478
18.4.4 Erhöhung des Signal zu Rausch Verhältnisses 480
18.4.5 Korrespondenzanalyse und Klassifizierung 484
18.4.6 Dreidimensionale Elektronenmikroskopie 486
18.5 Elektronentomographie individueller Objekte 490
18.5.1 Kryoelektronentomographie intakter Zellen 490
18.5.2 Identifizierung von Proteinkomplexen in
Zelltomogrammen 492
18.5.3 Perspektiven der Kryoelektronenmikroskopie 493
Weiterführende Literatur 494
19 Rasterkraftmikroskopie 495
19.1 Funktionsprinzip des Rasterkraftmikroskops 496
19.2 Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe 497
19.3 Präparationsverfahren 498
19.4 Abbilden biologischer Makromoleküle 499
19.5 Kraftspektroskopie einzelner Moleküle 501
Weiterführende Literatur 502
20 Röntgenstrukturanalyse 503
20.1 Kristallisation 503
20.2 Kristalle und Röntgenbeugung 505
20.3 Das Phasenproblem 508
20.3.1 Isomorpher Ersatz: single isomorphons
replacement (SIR) und multiple isomorphons
replacement (MIR) 508
20.3.2 Multiple anomale Dispersion (MAD) 510
20.3.3 Molekularer Ersatz (MR) 511
20.4 Modellbau und Strukturverfeinerung 511
Weiterführende Literatur 514
Teil III Spezielle Stoffgruppen
21 Analytik synthetischer Peptide 517
21.1 Prinzip der Peptidsynthese 517
21.2 Untersuchung der Reinheit synthetischer
Peptide 522
21.3 Charakterisierung und Identität synthetischer
Peptide 524
21.4 Charakterisierung der Struktur synthetischer
Peptide 528
21.5 Analytik von Peptidbibliotheken 529
Weiterführende Literatur 532
22 Kohlenhydratanalytik 533
22.1 Allgemeine stereochemische Grundlagen 534
22.1.1 Die Reihe der D Zucker 534
22.1.2 Stereochemie der D Glucose 535
22.1.3 Wichtige Monosaccharidbausteine 536
22.1.4 Die Reihe der L Zucker 537
22.1.5 Die glykosidische Bindung 538
22.2 Die Proteinglykosylierung 541
22.2.1 Aufbau der N Glykane 542
22.2.2 Der Aufbau der O Glykane 543
22.3 Glykoanalytik am intakten Glykoprotein 544
22.3.1 Ist mein Protein glykosyliert? 544
22.3.2 Charakterisierung der Glykosylierung mittels
Lectinen 547
22.3.3 Isoelektrische Fokussierung 548
22.3.4 Analyse der neutralen Monosaccharid
komponenten 549
22.3.5 Af Acetylneuraminsäure (Sialinsäure) 551
22.4 Freisetzung und Isolierung des A' Glykanpools 552
22.4.1 Enzymatische Freisetzung mittels PNGase F 552
22.4.2 Enzymatische Freisetzung mittels
Endoglykosidasen 553
22.4.3 Chemische Freisetzung mittels Hydrazinolyse 553
22.5 Isolierung einzelner A' Glykane 553
22.6 Charakterisierung der Glykane im Glykanpool 555
22.6.1 Mapping nicht derivatisierter A' Glykane 555
22.6.2 Kartierung derivatisierter A' Glykane 559
22.6.3 Kartierung mittels Kapillarelektrophorese
(CE) 562
22.7 Glykoanalytik isolierter A' Glykane
(Strukturanalyse) 564
22.7.1 Kompositionsanalyse 564
22.7.2 Methylierungsanalyse 566
22.7.3 Sequenzierung in Verbindung mit Gelfiltration 568
22.7.4 Massenspektrometrie (FAB MS, MALDI MS,
ESI MS) 569
22.7.5 'H NMR Spektroskopie 571
22.8 Genom, Proteom, Glykom 578
22.9 Schlussbetrachtung 579
Weiterführende Literatur 580
23 Lipidanalytik 581
23.1 Aufbau und Einteilung von Lipiden 581
23.2 Extraktion von Lipiden aus biologischem
Material 583
23.2.1 Flüssigphasenextraktion 583
23.2.2 Festphasenextraktion 584
23.3 Methoden der Lipidanalytik 585
23.3.1 Chromatographische Methoden 585
23.3.2 Massenspektrometrie 590
23.3.3 Immunoassays 591
23.3.4 Weitere Methoden in der Lipidanalytik 591
23.3.5 Online Kopplung verschiedener Analyse¬
systeme 593
23.4 Analytik ausgewählter Lipidklassen 595
23.4.1 Gesamtlipidextrakte 595
23.4.2 Fettsäuren 595
23.4.3 Unpolare Neutrallipide 597
23.4.4 Polare Esterlipide 599
23.4.5 Lipidhormone und intrazelluläre
Signaltransduktoren 602
23.5 Lipidvitamine 605
23.6. Lipidomanalytik 608
23.6 Ausblick 610
Weiterführende Literatur 611
24 Analytik posttransiationaler
Modifikationen: Phosphorylierung und
Acetylierung von Proteinen 613
24.1 Funktionelle Bedeutung von Phosphorylierung
und Acetylierung 613
24.1.1 Phosphorylierung 613
24.1.2 Acetylierung 614
24.2 Strategie zur Analyse der posttranslationalen
Phosphorylierung und Acetylierung von
Proteinen und Peptiden 615
Inhalt XV
24.3 Analyse posttranslational modifizierter
Proteine 617
24.3.1 Trennung und Anreicherung phosphorylierter
und acetylierter Proteine 617
24.3.2 Detektion phosphorylierter und acetylierter
Proteine mittels enzymatischer, radioaktiver,
immunchemischer und fluoreszenzbasierender
Methoden 618
24.3.3 Detektion phosphorylierter und acetylierter
Proteine mittels Massenspektrometrie 619
24.4 Analyse posttranslational modifizierter
Peptide 620
24.4.1 Trennung und Anreicherung phosphorylierter
und acetylierter Peptide 620
24.4.2 Detektion phosphorylierter und acetylierter
Peptide mittels Massenspektrometrie 622
24.5 Lokalisation und Identifizierung
posttranslational modifizierter Aminosäuren 624
24.5.1 Lokalisation phosphorylierter und acetylierter
Aminosäuren mittels Edman Sequenzierung 625
24.5.2 Lokalisation phosphorylierter und acetylierter
Aminosäuren mittels massenspektrometrischer
Fragmentionen Analyse 626
24.6 Quantitative Analyse phosphorylierter und
acetylierter Aminosäuren 628
24.7 Zukunft der Analytik posttranslationaler
Modifikationen 629
Weiterführende Literatur 630
Teil IV Nucleinsäureanalytik
25 Isolierung und Reinigung von
Nucleinsäuren 633
25.1 Reinigung und Konzentrationsbestimmung
von Nucleinsäuren 633
25.1.1 Phenolextraktion 633
25.1.2 Gelfiltration 634
25.1.3 Ethanolpräzipitation der Nucleinsäuren 635
25.1.4 Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäuren 636
25.2 Isolierung genomischer DNA 637
25.3 Isolierung niedermolekularer DNA 639
25.3.1 Isolierung von Plasmid DNA aus Bakterien 639
25.3.2 Isolierung niedermolekularer DNA aus
eukaryotischen Zellen 644
25.4 Isolierung viraler DNA 644
25.4.1 Isolierung von Phagen DNA 644
25.4.2 Isolierung von DNA aus eukaryotischen Viren 645
25.5 Isolierung einzelsträngiger DNA 646
25.5.1 Isolierung von Ml3 DNA 646
25.5.2 Trennung von einzel und doppelsträngiger
DNA 647
25.6 Isolierung von RNA 647
25.6.1 Isolierung von cytoplasmatischer RNA 648
25.6.2 Isolierung von poly(A)+ RNA 649
25.7 Isolierung von Nucleinsäuren unter
Verwendung von magnetischen Partikeln 650
Weiterführende Literatur 651
XVI Inhalt
26 Aufarbeitung von Nucleinsäuren 653
26.1 Restriktionsanalyse 653
26.1.1 Prinzip der Restriktionsanalyse 653
26.1.2 Historischer Überblick 654
26.1.3 Restriktionsenzyme 654
26.1.4 Der Restriktionsansatz und seine
Anwendungen 657
26.2 Elektrophorese 663
26.2.1 Gelelektrophorese von DNA 664
26.2.2 Gelelektrophorese von RNA 670
26.2.3 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) 672
26.2.4 Zweidimensionale Gelelektrophorese 675
26.2.5 Kapillargelelektrophorese 678
26.3 Färbemethoden 679
26.3.1 Fluoreszenzfarbstoffe 679
26.3.2 Silberfärbung 681
26.4 Nucleinsäureblotting 681
26.4.1 Blottingverfahren 681
26.4.2 Wahl der Membranen 682
26.4.3 Southern Blotting 683
26.4.4 Northern Blotting 685
26.4.5 Dot und Slot Blotting 686
26.4.6 Kolonie und Plaquehybridisierungen 687
26.5 Fragmentisolierung 688
26.5.1 Reinigung über Glas beads 688
26.5.2 Reinigung über Gelfiltrations oder reversed
p/wse Säulen 689
26.5.3 Elektroelution 689
26.5.4 Andere Methoden 690
26.6 LC MS von Oligonucleotiden 690
26.6.1 Prinzip der Synthese von Oligonucleotiden 690
26.6.2 Untersuchung der Reinheit und
Charakterisierung von Oligonucleotiden 693
26.6.3 Massenspektrometrische Untersuchung von
Oligonucleotiden 694
26.6.4 IP RP HPLC MS Untersuchung eines
Phosphorothioatoligonucleotids 696
Weiterführende Literatur 699
27 Hybridisierung und Nachweistechniken 701
27.1 Grundlagen der Hybridisierung 702
27.1.1 Prinzip und Durchführung der Hybridisierung 703
27.1.2 Spezifität der Hybridisierung und Stringenz 704
27.1.3 Hybridisierungsformate 705
27.2 Sonden zur Nucleinsäureanalytik 713
27.2.1 DNA Sonden 714
27.2.2 RNA Sonden 715
27.2.3 PNA Sonden 716
27.2.4 LNA Sonden 717
27.3 Markierungsverfahren 717
27.3.1 Markierungspositionen 719
27.3.2 Enzymatische Markierungsreaktionen 720
27.3.3 Photochemische Markierungsreaktionen 721
27.3.4 Chemische Markierungsreaktionen 722
27.4 Nachweissysteme 723
27.4.1 Färbemethoden 723
27.4.2 Radioaktive Systeme 723
27.4.3 Nichtradioaktive Systeme 725
j
I
27.5 Amplifikationssysteme 736 I
27.5.1 Targetamplifikation 737 j
27.5.2 Targetspezifische Signalamplifikation 738 ;
27.5.3 Signalamplifikation 738
Weiterführende Literatur 740
28 Polymerasekettenreaktion 743
28.1 Möglichkeiten der PCR 744
28.2 Grundlagen 746
28.2.1 Instrumentierung 746
28.2.2 Amplifikation von DNA 746
28.2.3 Amplifikation von RNA (RT PCR) 749
28.2.4 Optimierung der Reaktion 752
28.2.5 Quantitative PCR 753
28.3 Spezielle PCR Techniken 755
28.3.1 NestedVCR 755
28.3.2 Asymmetrische PCR 756
28.3.3 Einsatz von degenerierten Primern 756 :
28.3.4 Multiplex PCR 757 ;
28.3.5 Cycle sequencing 757
28.3.6 In vifro Mutagenese 758
28.3.7 Homogene PCR Detektionsverfahren 760
28.3.8 Quantitative Amplifikationsverfahren 760
28.3.9 In «ta PCR 760
28.3.10 Weitere Verfahren 761
28.4 Kontaminationsproblematik 761
28.4.1 Vermeidung von Kontaminationen 762
28.4.2 Dekontamination 763
28.5 Anwendungen 764
28.5.1 Nachweis von Infektionskrankheiten 764
28.5.2 Nachweis von genetischen Defekten 765
28.5.3 Humangenomprojekt 768
28.6 Alternative Verfahren der Amplifikation 769
28.6.1 Nucleic acid sequence based amplification
(NASBA) 769
28.6.1.1 Transcription mediated amplification (TMA) 771
28.6.2 Strand displacement amplification (SDA) 771
28.6.3 Ligase chain reaction (LCR) 772
28.6.4 Qß Amplifikation (Qß amplification) 113
26.6.5 Branched DNA amplification (bDNA) 774
28.7 Ausblick 774
Weiterführende Literatur 775
29 DNA Sequenzierung 777
29.1 Gelgestützte DNA Sequenzierungsverfahren 781
29.1.1 Sequenzierung nach Sanger: das Didesoxy
verfahren 781
29.1.2 Markierungstechniken und Nachweisverfahren 789
29.1.3 Chemische Spaltung nach Maxam und Gilbert 794
29.2 Gelfreie DNA Sequenzierungsmethoden 800
Weiterführende Literatur 803
30 Gezielte Genmodifikation in der Maus 805
30.1 Strategien zur gezielten Genmodifikation 806
30.2 Vom DNA Konstrukt zur Maus 807
30.2.1 Mikroinjektion von ES Zellen in Blastocysten,
Morulaaggregation von ES Zellen, ES Mäuse 807
30.2.2 Pronucleusinjektion von DNA, virale Infektion 810
30.3 Das Cre/loxP Rekombinasesystem als
Beispiel für einen Genschalter 812
30.4 Strategien zur gezielten Genmodifikation
unter Verwendung von Genschaltern 813
30.5 Konditionale Mutagenese 815
Weiterführende Literatur 819
31 Analyse der genomischen
DNA Methylierung 821
31.1 Überblick über die Detektionsmethoden
der DNA Methylierung 822
31.2 Methylierungsanalyse mit der Bisulfittechnik 823
31.2.1 Amplifikation und Sequenzierung von
bisulfitbehandelter DNA 824
31.2.2 Restriktionsanalyse nach Bisulfit PCR 825
31.2.3 Methylierungsspezifische PCR 826
31.3 Methylierungsanalyse mit Hydrazin und
Permanganatmodifikationen 827
31.4 Analyse der DNA mit methylierungs
speziflschen Restriktionsenzymen 828
31.5 Methylierungsanalyse durch methylcytosin
bindende Proteine 830
31.6 Methylierungsanalyse durch DNA Hydrolyse
und nearest neighbor Assays 831
31.7 Ausblick 832
Weiterführende Literatur 832
32 Protein Nucleinsäure Wechselwirkungen 833
32.1 DNA Protein Wechselwirkungen 833
32.1.1 Grundlagen der DNA Protein Erkennung:
helikale Doppelstränge 833
32.1.2 DNA Krümmung 834
32.1.3 DNA Topologie 836
32.2 DNA Bindungsmotive 837
32.3 Spezielle Analysemethoden 838
32.3.1 Filterbindung 838
32.3.2 Gelelektrophorese 839
32.3.3 Bestimmung von Dissoziationskonstanten 842
32.3.4 Analyse der Dynamik von DNA Protein
Komplexen 843
32.4 DN A footprint Analysen 845
32.4.1 Markierung der DNA 847
32.4.2 Primer ?.öe«.s/oM Analyse für DNA 847
32.4.3 Hydrolyse Methoden 848
32.4.4 Chemische Reagenzien für Modifikation
von DNA Protein Komplexen 850
32.4.5 Interferenzbedingungen 853
32.4.6 Chemische Nucleasen 854
32.5 Physikalische Analysen 855
32.5.1 Fluoreszenz Methoden 855
32.5.2 Fluorophore und Markierungsverfahren 856
32.5.3 Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) 856
32.5.4 Molekulare Lichtsonden (molecular beacons) 857
32.5.5 Surface plasmon resonance (SPR) 857
32.5.6 Scanning force microscopy (SFM) 859
32.5.7 Optical tweezer 859
32.5.8 Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) 859
32.6 RNA Protein Wechselwirkungen 860
Inhalt XVII
32.6.1 Funktionsvielfalt der RNA 860
32.6.2 RNA Sekundärstrukturparameter und
ungewöhnliche Basenpaarungen 861
32.6.3 Dynamik der RNA Protein Erkennung 861
32.7 Charakteristische RNA Bindungsmotive 863
32.8 Spezielle Methoden zur Analyse von RNA
Protein Komplexen 865
32.8.1 Limitierte enzymatische Hydrolyse 865
32.8.2 Markierungsmethoden 865
32.8.3 Primer extension von RNA 866
32.8.4 Gebräuchliche RNasen 867
32.8.5 Chemische Modifikation von RNA Protein
Komplexen 868
32.8.6 Chemische Quervernetzung 870
32.8.7 Einbau photoreaktiver Nucleotide 871
32.9 Genetische Methoden 872
32.9.1 Tri hybrid Methode 872
32.9.2 Aptamere und das Selex Verfahren 873
32.9.3 Gezielte Mutationen in Bindedomänen 874
Weiterführende Literatur 875
Teil V Systematische Funktions¬
analytik
33 Sequenzanalyse 879
33.1 Sequenzanalyse und Bioinformatik 879
33.2 Datenbanken 881
33.2.1 Datenabruf 881
33.3 Webdienste 885
33.4 Analyse der Sequenzzusammensetzung 885
33.5 Muster in Sequenzen 886
33.5.1 Sequenzsignale: funktionale Motive 887
33.5.2 Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren 888
33.5.3 Identifizierung codierender Bereiche in DNA 888
33.5.4 Proteinlokalisierung 889
33.5.5 Sekundärstruktur 890
33.6 Homologie 890
33.6.1 Identität, Ähnlichkeit und Homologie 890
33.6.2 Alignment 892
33.6.3 Optimales Alignment 893
33.6.4 Alignment für schnelle Datenbanksuchen:
BLAST 895
33.6.5 Profilbasierte Datenbanksuche: PSI BLAST 897
33.7 Multiples Alignment und Konsensussequenzen 897
33.8 Sequenz und Struktur 898
33.9 Ausblicke 899
Weiterführende Literatur 900
34 Analyse von Promotorstärke und aktiver
RNA Synthese 971
34.1 Methoden zur Analyse von RNA Transkripten 901
34.1.1 Überblick 901
34.1.2 Nuclease Sl Analyse von RNA 902
34.1.3 Ribonucleaseprotektionsassay (RPA) 905
34.1.4 Primerverlängerung (Primer ettension) 908
34.1.5 Northern Blot, Dot und Slot Blot 909
XVIII Inhalt
34.1.6 Quantitative Polymerasekettenreaktion
(real time PCR) 911
34.2 Analyse der RNA Syntheserate in vivo
(nuclear run on Ass y) 912
34.2.1 Zellaufschluss 912
34.2.2 Die nuclear ran on Transkription und
Detektion der Transkripte 913
34.3 Die in vftro Transkription Monierter Gene in
Extrakten und Proteinfraktionen 913
34.3.1 Komponenten des in vi'fro Transkriptions
ansatzes 913
34.3.2 Herstellung transkriptionsaktiver Extrakte
und Proteinfraktionen 914
34.3.3 Promotorspezifische Matrizen DNA und
Detektion der in vzVro Transkripte 914
34.4 Die in vi'vo Analyse Monierter Promotoren in
Säugerzellen 917
34.4.1 Plasmidvektoren für die Analyse von
czs aktiven Elementen in Säugerzellen 917
34.4.2 Einschleusen von Fremd DNA in Säugerzellen 919
34.4.3 Die Charakterisierung der in v/vo Transkripte
der Monierten Promotoren 920
Weiterführende Literatur 922
35 Fluoreszenzmarkierte DNA Hybridisierung
zur Genomanalyse in der molekularen
Cytogenetik 923
35.1 Methoden der fluoreszenzmarkierten DNA
Hybridisierung 924
35.1.1 Markierungsstrategie 924
35.1.2 DNA Sonden für FISH und CGH 924
35.1.3 Markierung der DNA Sonden 925
35.1.4 In .s/ta Hybridisierung 926
35.1.5 Fluoreszenzauswertung der Hybridisierungs
signale 927
35.2 Anwendungen: FISH und CGH 928
35.2.1 Analyse genomischer DNA durch FISH 928
35.2.2. Vergleichende genomische Hybridisierung
(CGH) 930
Weiterführende Literatur 933
36 Physikalische und genetische Gen
kartierung 935
36.1 Genetische Kartierung: Lokalisierung von
Loci im Genom 935
36.1.1 Rekombination 935
36.1.2 Genetische Marker 937
36.1.3 Kopplungsanalyse die Erstellung genetischer
Karten 939
36.1.4 Die genetische Karte des menschlichen
Genoms 941
36.1.5 Genetische Kartierung von Krankheitsgenen 942
36.2 Physikalische Kartierung 943
36.2.1 Restriktionskartierung ganzer Genome 943
36.2.2 Kartierung mittels rekombinanter Klone 945
36.2.3 Erstellung der physikalischen Karte 947
36.2.4 Isolierung und Identifizierung von Genen 949
36.2.5 Transkriptkarten des menschlichen Genoms 951
36.2.6 Gen und vererbbare Krankheit die
Mutationssuche 952
36.3 Integration der Genkarten 953
36.4 Das Humangenomprojekt 954
Weiterführende Literatur 955
37 Differenzielle Genaktivität 957
37.1 Grundprinzip des differential display 957
37.2 Experimentelle Durchführung des differential
display 958
37.2.1 RNA Isolierung 958
37.2.2 Synthese der cDNA 958
37.2.3 Amplifikation durch die erste PCR 959
37.2.4 Modifikationen der PCR und der Nachweis¬
reaktion 960
37.2.5 Polyacrylamidgelelektrophorese 961
37.2.6 Aufreinigung von PCR Produkten 961
37.2.7 Northern Blot Analyse 962
37.2.8 Klonierung der cDNAs 962
37.2.9 Alternative zur Northern Blot Analyse:
Microarray Analysen 963
37.3 Leistungsfähigkeit des differential display 963
37.3.1 Abgeleitete Methoden 963
37.3.2 Methodenkombinationen mit differential
display 963
37.3.3 Differential display und Microarray Analyse 964
37.4 Einsatzmöglichkeiten des differential display 964
Weiterführende Literatur 965
38 DNA Microarray Technologie 967
38.1 RNA Analysen 968
38.1.1 Transcriptional profiling 968
38.1.2 RNA Reifung 969
38.1.3 RNA Struktur und Funktionalität 969
38.2 DNA Analysen 969
38.2.1 DNA Kartierung 969
38.2.2 Comparative genomic Hybridisation (CGH) 970
38.2.3 Protein DNA Interaktionen 971
38.2.4 Genotypisierung 972
38.2.5 Epigenetische Studien 973
38.2.6 DNA Sequenzierung 973
38.3 Molekülsynthese 974
38.3.1 DNA Synthese 974
38.3.2 Herstellung von RNAi 975
38.3.3 Chipgebundene Proteinexpression 975
38.4 Neue Ansätze 976
38.4.1 Eine universelle Chip Plattform 976
38.4.2 Strukturanalysen 976
38.4.3 Jenseits von Nucleinsäuren 977
Weiterführende Literatur 977
39 Oligonucleotide als zellbiologische
Werkzeuge 979
39.1 AnZ/se/zse Oligonucleotide 980
39.1.1 Wirkweisen von an/we/we Oligonucleotiden 981
39.1.2 Triplexbildende Oligonucleotide 982
39.1.3 Modifikationen von Oligonueleotiden zur
Steigerung der Nucleasestabilität 982
39.1.4 Einsatz von antisense Oligonucleoüden in
Zellkultur und in Tiermodellen 984
39.1.5 Antisense Oligonucleotidt als neue
Arzneimittel 985
39.2 Ribozyme 986
39.2.1 Entdeckung und Klassifikation von
Ribozymen 986
39.2.2 Anwendungen von Ribozymen 986
39.3 RNA Interferenz 987
39.3.1 Grundlagen der RNA Interferenz 987
39.3.2 RNA Interferenz durch Expressionsvektoren 988
39.3.3 Anwendungen der RNA Interferenz 989
39.4 Aptamere: Hoch affine RNA und DNA
Oligonucleotide 990
39.4.1 Selektion von Aptameren 990
39.3.2 Anwendungen von Aptameren 992
39.5 Ausblick 992
Weiterführende Literatur 993
40 Proteomanalyse 995
40.1 Definition der Ausgangsbedingungen und
der Fragestellung, Projektplanung 998
40.2 Probenvorbereitung 999
40.3 Die quantitative Analyse des Proteoms 1000
40.3.1 Klassische gelbasierte Proteomanalyse 1001
40.3.2 Zweidimensionale differenzielle Gel¬
elektrophorese (2D DIGE) 1005
40.3.3 Nicht gelbasierte Proteomanalyse 1006
40.4 Bioinformatik 1014
40.5 Diskussion und Ausblick 1014
Weiterführende Literatur 1016
41 Metabolomics und Peptidomics 1017
41.1 Systembiologie und Metabolomics 1018
41.2 Technologische Plattformen für Metabolomics 1019
41.3 Metabolomisches profiling 1021
41.4 Peptidomics 1022
41.5 Metabolomics knowledge mining 1023
41.6 Data mining 1024
41.7 Anwendungsfelder 1025
41.8 Ausblick 1026
Weiterführende Literatur 1026
42 Interactomics Systematische Protein
Protein Wechselwirkungen 1027
42.1 Protein Microarrays 1027
42.1.1 Sensitivität durch Miniaturisierung — ambient
analyte assay 1028
42.1.2 Von DNA zu Protein Microarrays 1030
42.1.3 Anwendungen von Protein Microarrays 1031
Weiterführende Literatur 1033
Inhalt XIX
43 Toponomanalyse 1035
43.1 Lichtmikroskopische Methoden im
Hochdurchsatz 1035
43.2 Antikörperbasierte Toponomanalyse mit
Multi Epitop Ligand Kartierung (MELK) 1036
43.2.1 Konzept des Proteintoponoms 1037
43.2.2 Imaging cycler robots: Grundlage einer
Toponomlesetechnologie 1038
43.2.3 Ein Beispiel: Spezifität und Selektivität
des Zelloberflächentoponoms 1039
43.2.4 Methoden der Toponomanalyse 1040
43.2.5 Zusammenfassung und Ausblick 1047
43.3 Abbildende Massenspektrometrie 1048
43.3.1 Analytische Mikrosonden 1048
43.3.2 Images: Massenspektrometrische Rasterbilder 1049
43.3.3 SMALDI MS: Das Matrixdilemma 1049
43.3.4 SIMS und ME SIMS imaging: Die
Erweiterung des Massenbereichs 1050
43.3.5 Auflösung versus Empfindlichkeit 1050
43.3.6 Organe und Gewebe: MALDI imaging mit
niedriger Auflösung 1051
43.3.7 Biologische Zellen und Zellorganellen:
MS imaging mit hoher Auflösung 1051
43.3.8 Identifizierung und Charakterisierung 1052
Weiterführende Literatur 1052
44 Systembiologie 1055
44.1 Ziele der Systembiologie 1055
44.1.1 Definition 1055
44.2 Methodische Ansätze 1056
44.2.1 Modellaufbau 1056
44.2.2 Induktiver versus deduktiver Lösungsansatz 1056
44.2.3 Mathematische Werkzeuge 1057
44.3 Beispiele für systembiologische Modelle 1058
44.3.1 Studien in der pharmakologischen Forschung 1058
44.3.2 Signaltransduktion JAK/STAT 1060
44.3.3 Signaltransduktion EGF Rezeptor/MAPK 1061
44.4 Hürden und Perspektiven für die System¬
biologie 1062
44.5 Internationale Forschungsnetzwerke 1062
Weiterführende Literatur 1063
Anhang
Anhang 1: Strahlenschutz im Labor 1067
Anhang 2: Aminosäuren und posttranslationale
Modifikationen 1093
Anhang 3: Symbole und Abkürzungen 1095
Index 1101 |
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