HPLC richtig optimiert: ein Handbuch für Praktiker
Gespeichert in:
| Format: | Buch |
|---|---|
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Weinheim
Wiley-VCH
2006
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Hier auch später erschienene, unveränderte Nachdrucke |
| Beschreibung: | XXIX, 781 S. Ill., graph. Darst. |
| ISBN: | 3527314709 9783527314706 |
Internformat
MARC
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|---|---|
| adam_text | VII
Inhaltsverzeichnis
Vorwort
Autorenverzeichnis
Zum Aufbau des Buches XXVII
1 Grundsätzliches zur Optimierung 1
1.1 Grundsätze der Optimierung in der HPLC am Beispiel der
RP-Chromatographie 3
Stavros Kromidas
1.1.1 Vor den ersten Optimierungsschritten 3
1.1.2 Was heißt eigentlich „Optimierung ? 6
1.1.3 Verbesserung der Auflösung („besser trennen ) 6
1.1.3.1 Prinzipielle Möglichkeiten zur Verbesserung der Auflösung 8
1.1.3.2 Was „bringt das meiste? 10
1.1.3.3 Welche Reihenfolge der Maßnahmen ist bei Optimierungsversuchen
sinnvoll? 12
1.1.3.4 Wie ändere ich k,
1.1.3.4.1 Isokratischer Modus 18
1.1.3.4.2 Gradientenmodus 29
1.1.3.4.3 Acetonitril oder Methanol? 20
1.1.4 Überprüfung der Peakhomogenität - das Drei-Stufen-Modell 22
1.1.5 Unbekannte Probe - wie soll ich anfangen? Strategien und
Konzepte 36
1.1.5.1 Die .¿-Tage-Methode 37
1.1.5.2 „Das S-Schritte-Modell 41
1.1.6 Verkürzung der Analysendauer („schneller trennen ) 50
1.1.7 Empfindlichkeit erhöhen („mehr sehen , d. h. Nachweisgrenze
erniedrigen) 52
1.1.8 Ökonomie in der HPLC („billiger trennen ) 52
1.1.9 Abschlussbemerkungen und Ausblick 54
Literatur 61
HPLC richtig optimiert: Ein Handbuch ßr Praktiker. Herausgegeben von
Copyright © 2006 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
ISBN: 3-527-31470-9
VIII
1.2 Schnelle Gradienten 63
Uwe Dieter Neue, Yung-Fong
1.2.1 Einleitung 63
1.2.2 Hauptteil 63
1.2.2.1 Theorie 63
1.2.2.2 Ergebnisse 65
1.2.2.2.1 Generelles 65
1.2.2.2.2 Kurze Säulen, Meine Teilchen 67
1.2.2.2.3 Ein konkretes Beispiel 69
1.2.2.3 Optimale Flussraten und Grenzen der heutigen Technologie 70
1.2.2.4 Apparative Schwierigkeiten und Lösungen 71
1.2.2.4.1 Umgehung des Gradientenverweilvolumens 71
1.2.2.4.2 Zeitkonstante und Datenaufhahmerate 73
1.2.2.4.3 Messung der Ionenunterdrückung mithilfe der Nachsäulen¬
infusion 73
Literatur 75
13 Selektivitätsänderung in der RP-HPLC mithilfe des pH-Wertes 77
Uwe Dieter Neue, Alberto
1.3.1 Einleitung 77
1.3.2 Hauptteil 77
1.3.2.1 Ionisierung und pH 77
1.3.2.2 Mobile Phase und pH-Wert 79
1.3.2.2.1 Pufferkapazität 81
1.3.2.2.2 Änderung von pK- und pH-Werten durch den Zusatz des
organischen Lösungsmittels 82
1.3.2.3 Puffer 85
1.3.2.3.1 Klassische Puffer 85
1.3.2.3.2 MS-kompatible pH-Wert-Kontrolle 85
1.3.2.4 Einfluss der Proben auf die Retention 86
1.3.2.4.1 Der Probentyp: Säuren, Basen, Zwitterionen 86
1.3.2.4.2 Der Einfluss des organischen Lösungsmittels auf die Ionisierung
der Proben 87
1.3.3 Anwendungsbeispiel 88
1.3.4
1.3.4.1 Reproduzierbarkeitsprobleme 92
1.3.4.2 Pufferstärke und Löslichkeit 92
1.3.4.3 Konstante Pufferkonzentration 93
1.3.5 Ausblick 93
Literatur 94
Inhaltsverzeichnis
1.4 Auswahl des richtigen pH-Wertes in der HPLC 95
Michael McBrien
(Übersetzung aus dem Englischen von Sven Fischer)
1.4.1 Einleitung 95
1.4.2 Typische Vorgehensweisen zur Wahl des pH-Wertes 96
1.4.3 Auswahl des Anfangs-pH-Wertes 97
1.4.4 Grundlage für die Vorhersage/Berechnung eines piCs-Wertes 98
1.4.5 Korrektur des pH-Wertes aufgrund des organischen Anteils im
Eluenten 99
1.4.6 Optimierung des pH-Wertes der mobilen Phase ohne Kenntnis
der chemischen Struktur der Analyte 102
1.4.7 Eine systematische Vorgehensweise zur Auswahl des pH-Wertes 103
1.4.8 Beispiel: Trennung von M-Bistß-pyriden^-ylethylJthiolbutan-
2,3-diol von seinen Verunreinigungen 104
1.4.9 Fehlersuche beim pH-Wert der mobilen Phase 109
1.4.10 Ein Blick in die Zukunft 110
1.4.11 Zusammenfassung HO
Literatur 111
1.5 Optimierung der Auswertung in der Chromatographie 113
Hans-Joachim
1.5.1 Auswertung und Bewertung chromatographischer Daten -
eine Einführung 113
1.5.2 Arbeitsbereich 113
1.5.3 Interner Standard 114
1.5.4 Kalibrierung 115
1.5.5 Lineare Regression 116
1.5.6 Wichtungsexponent 118
1.5.7 In der Praxis 120
1.5.8 Pharmaanalytik 120
1.5.9 Messunsicherheit 121
1.5.10 Nullpunktsgerade 123
Literatur 124
1.6 Gütekennwerte der Kalibration und Messunsicherheit als
Indikatoren für Optimierungspotenzial 225
Stefan Schömer
1.6.1 Optimierung der Kalibration - was ist das Ziel? 125
1.6.2 Der zentrale Gütekennwert einer Kalibration 126
1.6.3 Beispiele 126
1.6.3.1 Bedeutet eine höhere Empfindlichkeit auch eine bessere Methode? 126
1.6.3.2 Ist ein konstanter Variationskoeffizient gut oder schlecht -
oder einfach unvermeidbar? 130
XI
1.6.3.3 Matrixeffekte nachweisen - ist die Wiederfmdungsfunktion
ersetzbar? 140
1.6.3.4 Matrixeffekte nachgewiesen - ist ein Aufstockverfahren immer
notwendig? 143
1.6.3.5 Der Linearitätstest -
1.6.3.6 Richtigkeit optimieren - robuste Kalibrationsfunktion
mit Gewichtung ermitteln 150
Literatur 154
2 Die
2.1 RP-HPLC 157
2.1.1 Säulenvergleich und-auswahl in der RP-HPLC 157
Stavros Kromidas
2.1.1.1 Einleitung 157
2.1.1.2 Gründe für die Vielfalt von kommerziellen RP-Säulen -
erste Konsequenzen 157
2.1.1.2.1 Über polare Wechselwirkungen 162
2.1.1.2.2 Erste Konsequenzen 162
2.1.1.3 Kriterien zum Vergleich von RP-Phasen 181
2.1.1.3.1 Ähnlichkeit über die physikalisch-chemischen Eigenschaften 181
2.1.1.3.2 Ähnlichkeit über das chromatographische Verhalten,
Aussagekraft von Retentions- und Selektivitätsfaktoren 181
2.1.1.3.3 Tests zum Vergleich von Säulen und deren Aussagekraft 188
2.1.1
2.1.1.4.1 Selektivitätskarten 203
2.1.1.4.2 Selektivitätsplots 207
2.1.1.4.3 Selektivitätshexagone 212
2.1.1.4.4 Chemometrische Analyse der chromatographischen Daten 236
2.1.1.5 Eignung von RP-Phasen für bestimmte Analyttypen und Vorschläge
zur Säulenauswahl 241
2.1.1.5.1 Polare und hydrophobe RP-Phasen 241
2.1.1.5.2 Eignung von RP-Phasen für bestimmte Substanzklassen 245
2.1.1.5.3 Vorschläge zur Säulenauswahl 256
Literatur 261
2.1.2 Grundlagen der Selektivität von RP-Säulen 262
Uwe Dieter Neue,
2.1.2.1 Einleitung 262
2.1.2.2 Hauptteil 263
2.1.2.2.1 Hydrophobie und Silanolgrappenaktivität (Ionenaustausch) 263
2.1.2.2.2 Polare Wechselwirkungen (Wasserstoffbrückenbindung) 268
2.1.2.2.3 Reproduzierbarkeit der Selektivität 269
Literatur 271
Inhaltsverzeichnis
2.1.3 Charakterisierung von Umkehrphasen in der Flüssigkeits¬
chromatographie mittels Hauptkomponentenanalyse 272
Melvin R. Euerby und
(Übersetzung aus dem Englischen von Ulrich Panne)
2.1.3.1 Einleitung 272
2.1.3.2 Theorie der Hauptkomponentenanalyse 273
2.1.3.3 PCA der Datenbank mit RP-Kieselgel-Materialien 275
2.1.3.3.1 PCA von „polar
mit erhöhter polarer Selektivität 277
2.1.3.3.2 PCA von perfluorierten Phasen 278
2.1.3.4 PCA zur Identifizierung der Ähnlichkeit/Äquivalenz von Säulen und
Phasen 279
2.1.3.5 PCA für eine systematische Auswahl von stationären Phasen für die
Methodenentwicklung 286
2.1.3.5.1 Optimierungsstrategie für Eluent und stationäre Phase 287
Literatur 288
2.1.4 Chemometrie - ein geeignetes Werkzeug für die Verarbeitung von
großen Datensätzen 289
Cinzia
(Übersetzung aus dem Englischen von Ulrich Panne)
2.1.4.1 Einleitung 289
2.1.4.2 Chromatographische Tests und ihre Bedeutung für die Auswahl
der Trennsäule 289
2.1.4.3 Der Einsatz der Hauptkomponentenanalyse (PCA) für die Bewertung
und Auswahl von Testverbindungen 290
2.1.4.3.1 Physikochemische Eigenschaften der Testverbindungen 290
2.1.4.3.2 Chromatographische Eigenschaften der Testverbindungen 293
2.1.4.4 Der Einsatz der Hauptkomponentenanalyse (PCA) für die
Beurteilung von chromatographischen Trägermaterialien 294
2.1.4.4.1 Bewertung der stationären Phasen mit Phosphatpuffer
bei pH 7,0 als mobiler Phase 296
2.1.4.4.2 Bewertung der chromatographischen Phasen mit Phosphatpuffer
bei pH 3,0 als mobiler Phase 298
2.1.4.5 Optimierung eines chromatographischen Verfahrens durch
Chemometrie 300
2.1.4.5.1 Tesrverbindungen 300
2.1.4.5.2 Mobile Phasen 301
2.1.4.5.3 Chromatographische Parameter und Vergleichspräzision
der Chargen und Trennsäulen 302
2.1.4.6 Zusammenfassung und Ausblick 304
Literatur 305
Xlii Inhaltsverzeichnis
2.1.5 Lineare Freie Enthalpiebeziehungen (LFER) - Werkzeuge zur
Säulencharakterisierung und Methodenoptimierung? 306
Frank Steiner
2.1.5.1 Charakterisierung und Auswahl stationärer Phasen für die HPLC 306
2.1.5.2 Was sind LFER und warum sind sie für die HPLC von
Bedeutung? 307
2.1.5.3 Der Weg zu molekularen Deskriptoren für die multivariate
Regression 310
2.1.5.4 Beispiel für eine LFER-Prozedur mittels der Solvatationsgleichung 311
2.1.5.4.1 Vergleich stationärer Phasen basierend auf LFER-Parametern 311
2.1.5.4.2 Beschreibung des Einflusses der mobilen Phase mit
LFER-Regressionsparametern 318
2.1.5.4.3 Die Vorhersagbarkeit von Selektivitäten mittels LFER-Parametem 320
2.1.5.5 Empirischer Ansatz zur Bestimmung von Analytdeskriptoren
(und Phasenparametern) mittels HPLC 322
2.1.5.5.1 Das Prinzip im Unterschied zur Strategie mit vorgegebenen
Deskriptoren 322
2.1.5.5.2 Die experimentelle Durchführung 323
2.1.5.5.3 Bestimmung der fünf LFER-Parameter - eine Strategie in acht
Schritten 324
2.1.5.5.4 Variation der Elutionsbedingungen 327
2.1.5.5.5 Phasencharakterisierung mittels empirischer LFER-Parameter 330
2.1.5.6 Abschließende Betrachtung zur LFER-Anwendung in der HPLC 332
Literatur 333
2.1.6 Säulenselektivität von RP-Säulen 334
L R.
(Übersetzung aus dem Englischen von Hans-Joachim
2.1.6.1 Einleitung 334
2.1.6.2 Das
2.1.6.3 Anwendungen 340
2.1.6.3.1 Auswahl äquivalenter Säulen [18] 340
2.1.6.3.2 Auswahl von Säulen mit sehr unterschiedlicher Selektivität 344
2.1.6.4 Fazit 345
Nomenklatur 346
Literatur 347
2.1.7 Selektivität verstehen durch Suspended-State-High-Resolution-
Magic-Angle-Spinning NMR-Spektroskopie 348
Urban Skogsberg,
2.1.7.1 Einführung 348
2.1.7..2 Ist der Vergleich zwischen NMR und HPLC zulässig? 352
2.1.7.3 Der transfer-Nuclear-Overhauser-Effekt (trNOE) 355
Inhaltsverzeichnis
2.1.7.4
2.1.7.5 Wo finden die Wechselwirkungen statt? 359
2.1.7.6 Wasserstoffbrückenbindungen 360
2.1.7.7 Einige praktische Gesichtspunkte 360
2.1.7.8 Ausblick 362
Literatur 362
2.2 Optimierung in der Normalphasen-Chromatographie 363
Veronika R. Meyer
2.2.1 Einleitung 363
2.2.2 Eluenten in der NP-HPLC 364
2.2.3 Stationäre Phasen in der NP-HPLC 368
2.2.4
Weiterführende Literatur 371
2.3 Optimierung von GPC-Analysen durch geeignete Wahl von
stationärer Phase und Detektionsverfahren 373
Peter KHz
2.3.1 Einleitung 373
2.3.2 Grundlagen der
2.3.2.1 Trermmechanismen in der Säule 376
2.3.2.2 Kriterien zur Auswahl von GPC-Säulen und Optimierung
von
2.3.2.2.1 Auswahl von Porengröße und Trennbereich 379
2.3.2.2.2 Vor- und Nachteile von Linearsäulen 380
2.3.2.3 Hochgeschwindigkeits (HighSpeedJ-GPC-Trennungen 381
2.3.3 Umfassende Detektionsmöglichkeiten zur Aufklärung
makromolekularer Materialien 383
2.3.3.1 Anwendung informationsreicher Detektoren in der
Flüssigchromatographie 385
2.3.3.2 Analyse von Copolymeren mit Multidetektions-GPC 386
2.3.3.3 Simultane Trennung und Identifizierung durch GPC-FTIR-
Kopplung 390
2.3.3.4 Anwendung molmassensensitiver Detektoren in der GPC 392
2.3.3.4.1 Lichtstreudetektoren 392
2.3.3.4.2 GPC-Viskosimetrie-Kopplung 394
2.3.4 Zusammenfassung 395
Literatur 396
2.4 Gelfiltration - Größenausschluss-Chromatographie von
Biopolymeren - Optimierungsstrategien und Fehlersuche 397
M.
2.4.1 Ausgangssituation und gegenwärtige Trends 397
2.4.2 Spezifische, grandlegende Aspekte der
XIV
2.4.3 Vergleich der
2.4.4 Aspekte bei der Optimierung der
2.4.4.1 Säulenauswahl und optimale Flussrate 403
2.4.4.2 Optimierung der Fließmittelzusammensetzung 408
2.4.4.3 Probenvorbehandlung 420
2.4.4.4 Viskosität und Volumen der Probenlösung - zwei kritische
Parameter bei der Dosierung 410
2.4.4.5 Detektionsmethoden 411
2.4.5 Anwendungsfelder der
2.4.5.1 High Performance
2.4.5.2 Bestimmung des Molekulargewichtes 412
2.4.5.3 Die Gelfiltration als ein Werkzeug zum Studium von
Konformationsänderungen von Proteinen 413
2.4.5.4 Die Gelfiltration in der präparativen und Prozesschromatographie
(Down Stream
2.4.5.5 SEC-Säulen basierend auf dem Prinzip der eingeschränkten
Zugänglichkeit
der Proteomanalyse 415
Literatur 418
2.5 Optimierung in der Affinitätschromatographie 419
Egbert Müller
2.5.1 Einführung und Grundlagen der Affinitätschromatographie 419
2.5.2 Auswahl der Basismaterialien 423
2.5.3 Immobilisierungsmethoden 424
2.5.4 Aktivierungsmethoden 425
2.5.5
2.5.6 Gerichtete Immobilisierung 432
2.5.7 Nicht-partikuläre Affinitätsträger 433
2.5.8 Durchführung einer Affinitätsreinigung 434
2.5.9 Anwendung von mathematischen Optimierungsmethoden 436
2.5.10 Empfehlungen zur Immobilisierung in Kurzform 441
Literatur 442
2.6 Optimierung von Enantiomerentrennungen in der HPLC* 445
Markus Juza
2.6.1 Einleitung 445
2.6.2 Grundlegende Prinzipien der enantioselektiven HPLC 445
2.6.2.1 Thermodynamische Grundlagen der enantioselektiven HPLC 448
2.6.2.2 Adsorption und chirale Erkennung 449
2.6.2.3 Unterschiede zur RP- und NP-HPLC 451
2.6.2.4 Grundsätzliches zur Optimierung enantioselektiver HPLC-
Trennungen 452
2.6.3 Selektoren und stationäre Phasen 452
Inhaltsverzeichnis
2.6.4 Methodenwahl und Optimierung 460
2.6.4.1
2.6.4.2 Immobilisierte
2.6.4.3 Tartratphasen 464
2.6.4.4 TC-Acide und n-basische stationäre Phasen 464
2.6.4.5 Makrocyclische Selektoren, Cyclodextrine und Antibiotika 466
2.6.4.6 Proteine und
2.6.4.7 Rutheniumkomplexe 470
2.6.4.8 Synthetische und
2.6.4.9 Metallkompexierungs- und Ligandenaustauschphasen 471
2.6.4.10 Chirale Ionentauscher 471
2.6.5 Fehlervermeidung und
2.6.5.1 Geräte und Säulen - praktische Tipps 472
2.6.5.2 Detektion 473
2.6.5.3 Fehlerquellen aus dem Analyten 473
2.6.6 Präparative enantioselektive HPLC 475
2.6.6.1 Bestimmung der Beladung 476
2.6.6.2 Bestimmung der Elutionsvolumina und der Flussrate 476
2.6.6.3 Enantiomerentrennungen mittels
Chromatography (SMB)
2.6.6.3.1 Prinzip der
2.6.6.3.2 Kommerzielle Wirkstoffe, die mittels SMB getrennt werden 480
2.6.7
mobilen Phase in HPLC und Kapillarelektrophorese 480
2.6.8 Bestimmung der Enantiomerenreinheit durch Bildung von
Diastereomeren 482
2.6.9 Indirekte Enantiomerentrennung im präparativen Maßstab 483
2.6.10 Enantiomerentrennung unter superkritischen chromatographischen
Bedingungen (SFC) 483
2.6.11 Neue chirale stationäre Phasen und Informationssysteme 484
2.6.12 Fazit 484
Literatur 485
2.7 Miniaturisierung 487
2.7.1 uLC/Nano-LC - Optimierungsmöglichkeiten und Fehlervermeidung
aus Anwendersicht 487
Jürgen Maier-Rosenkranz
2.7.1.1 Einleitung 487
2.7.1.2 Empfindlichkeit - wie kann ich sie erhöhen? 487
2.7.1.2.1 Einfluss der Säulenlänge 487
2.7.1.2.2 Einfluss des Säuleninnendurchmessers 487
2.7.1.2.3 Einfluss der stationären Phase 489
2.7.1.3 Robustheit 489
2.7.1.3.1 Systemauswahl 489
XVI
2.7.1.3.2 Kapillarverbindungen 492
2.7.1.3.3 Maßnahmen gegen Verstopfen 497
2.7.1.3.4 Lecksuche 498
2.7.1.3.5 Vorsäulenschaltungen - Probenauftragsstrategien 499
2.7.1.4 Empfindlichkeit/Auflösung 504
2.7.1.4.1 Säulendimensionierung 504
2.7.1.4.2 Packmaterial/Belegungstypen 505
2.7.1.4.3 Detektoren 505
Literatur 507
2.7.2 Mikrochip-basierte Flüssigchromatographie -
Techniken und Möglichkeiten 508
Jörg P. Kutter
2.7.2.1 Einführung in die Thematik 508
2.7.2.2 Verschiedene Techniken 509
2.7.2.2.1 Druckgetriebene Flüssigchromatographie (LC) 509
2.7.2.2.2
2.7.2.2.3 Elektrochromatographie in gepackten Kanälen 510
2.7.2.2.4 Labyrinth-artige
der stationären Phase
2.7.2.2.5 In situ polytnerisierte monolithische stationäre Phasen 511
2.7.2.3 Optimierung der Systeme und ihre Potenziale 511
2.7.2.3.1 Trennleistung 511
2.7.2.3.2 Isokratische- und Gradientelution 5J2
2.7.2.3.3 Maßgeschneiderte stationäre Phasen 513
2.7.2.3.4 Kopplung auf dem Mikrochip zur integrierten Probenvorbereitung
und mehrdimensionalen Trennung 514
2.7.2.3.5 Schwierigkeiten und Herausforderungen 514
2.7.2.4 Anwendungsbeispiele 515
2.7.2.5 Abschließende Bewertung und Ausblick 518
Literatur 519
2.7.Í
Uwe D. Neue, Eric S. Crumbach, Marianna Kele, Jeffrey R. Mazzeo
und Dirk Sievers
2.7.3.1 Einführung 520
2.7.3.2 Isokratische Trennungen 521
2.7.3.3 Gradiententrennungen 524
2.7.3.4 Fazit 528
Literatur 528
Inhaltsverzeichnis
3 Kopplungstechniken 529
3.1 Immunchromatographische Kopplungen 53 /
Michael C. Weller
3.1.1 Hinführung 53/
3.1.2 Bindungsmoleküle 531
3.1.3 hntiuinoassays 533
3.1.4 Initnunchromatographisclie Techniken 533
3.1.4.1 Affinitätsanreichenmg
3.1.4.2 Hellte Affinitätsehromatographie
(„Weak Affinity
3.1.4.
5.1.
3.1.5.1 Beispiel 1: Affinitätsextraktion
3.1.5.2 Beispiel 2:
3.1.5.3 Beispiel*: Biochemische Detektion 547
Literatur
3.2 Erweiterte Charakterisierungs- und Analysemöglichkeiten
durch 2-dimensionale Chromatographie 549
Peter KHz
3.2.1 Einleitung 549
.l.2
Ї.ІЛ
3.2.4 Stand der Technik in der
Í.2.J
Literatur 562
3.3 LC-M
Friedrich Mandel
3.3.1 Optimieren des lonisationsprozesses 563
3.3.2 Verschwundene
3.3.2.1 Grenzweniger pH-Wert der mobilen Phase 565
3.3.2.2 lonenpaarbildnerim HPLC-System 565
Î.
Probenmatrix oder Kontaminantien 566
3.3.3 Wie sauber
Ì3A
L xeroxe
XVIII Inhaltsverzeichnis
3.4 LC-NMR-Kopplung 573
Klaus Albert, Manfred Krucker, Marc David Grynbaum und
Karsten Putzbach
ЗАЛ
3.4.2 Empfindlichkeit des NMR-Experimentes 574
3.4.3 NMR-Spektroskopie in fließenden Systemen 575
3.4.4 NMR-Messköpfe zur LC-NMR-Kopplung 575
3.4.5 Praktische Durchführung der analytischen HPLC-NMR-Kopplung
und der Kapillar-HPLC-NMR-Kopplung 576
3.4.6 Durchfluss-Messungen 577
3.4.7 Stopped-Flow-Messverfahren 580
3.4.8 Kapillartrennungen 581
3.4.9 Ausblick 583
Literatur 586
4 Computer-unterstützte Optimierung 587
4.1 Computer-unterstützte HPLC-Methodenentwicklung mit der
DryLab®-Software 589
Lloyd R. Snyder und Loren Wrisley
(Übersetzung aus dem Englischen von Christine
4.1.1 Einleitung 589
4.1.1.1 Rückblick 591
4.1.1.2 Theorie 592
4.1.2 Die Möglichkeiten von DryLab 592
4.1.2.1 Die Funktionsweise von DryLab 592
4.1.2.2 Modus-Auswahl 593
4.1.3 Praktische Anwendungen von DryLab im Labor 594
4.1.4 Zusammenfassung und Ausblick 608
Literatur 609
4.2 ChromSwordfSj-Software
unterstützte HPLC-Methodenentwicklung 611
S. Calushko,
4.2.1 Einführung 611
4.2.1.1 Offline-Modus 631
4.2.1.2 Online-Modus 611
4.2.2 ChromSword®-Versionen 611
4.2.3 Anbindung eines HPLC-Systems im Online-Modus 612
4.2.4 Methodenentwicklung mit ChromSword® 613
4.2.4.1 Offline-Modus (Computer-unterstützte Methodenentwicklung) 623
4.2.4.2 Online-Modus - vollautomatische Optimierung von isokratischen
und Gradienten-Trennungen 617
Inhaltsverzeichnis XIX
4.2.4.2.1 Software-Funktionen für die Automatisierung 622
4.2.4.2.2 Wie optimiert das System HPLC-Trennungen? 622
4.2.5 Fazit 625
Literatur 626
4.3 Multifaktorielle systematische Methodenentwicklung
und -Optimierung in der Umkehrphasen-HPLC 627
Michael Pfeffer
4.3.1 Einleitung und
4.3.2 Strategie für teilautomatisierte Methodenentwicklungen 630
4.3.3 Vergleich kommerziell erhältlicher Software im Hinblick auf den
Beitrag zur
4.3.4 Entwicklung eines neuen Systems zur multifaktoriellen
Methodenentwicklung 636
4.3.4.1 Auswahl stationärer Phasen 637
4.3.4.2 Methodenoptimierung mit HEUREKA 639
4.3.4.3 Auswertung der Daten mit HEUREKA 645
4.3.5 Fazit und Ausblick 650
Literatur 650
5 „Anwender berichten 652
5.1 Nano-LC-MS/MS in der Proteomforschung 653
Heike Schäfer, Christiane Lohaus, Helmut E. Meyer und Katrin Marcus
5.1.1 Proteomforschung - eine Einführung in die Thematik 653
5.1.2 Probenvorbereitung für die Nano-LC 654
5.1.3 Nano-LC 655
5.1.4 Online-LC-ESI-MS/MS-Kopplung 660
5.1.5 Offline-LC-MALDI-MS/MS-Kopplung 661
5.1.5.1 Probenfraktionierung 661
5.1.5.2 MALDI-TOF-MS/MS-Analysen 663
5.1.6 Datenanalyse 663
5.1.7 Anwendungsbeispiel: Analyse des a-Crystallin
der Maus 664
Literatur 667
5.2 Wege zur Überprüfung der Robustheit in der RP-HPLC 669
Hans Büke
5.2.1 Zur Überprüfung der Robustheit 669
5.2.2 Robustheitstest in der analytischen RP-HPLC mittels systematischer
Methodenentwicklung 669
5.2.3 Robustheitstest in der analytischen RP-HPLC mittels statistischer
Versuchsplanung (DoE) 679
Literatur 693
XX
5.3 Trennung komplexer Proben 695
Knut Wagner
5.3.1 Einleitung 695
5.3.2 Mehrdimensionale HPLC 695
5.3.3 Techniken der mehrdimensionalen Trennung 697
5.3.3.1 Offline-Technik 697
5.3.3.2 Online-Technik 698
5.3.4 Online Probenvorbereitung als Vorstufe der mehrdimensionalen
HPLC 699
5.3.5 Anwendungsgebiet der mehrdimensionalen HPLC 702
5.3.5.1 Was ist realisierbar? - ein Beispiel aus der Praxis 702
5.3.6 Kritische Parameter der mehrdimensionalen HPLC 707
Literatur 708
5.4 Evaluierung eines integrierten Verfahrens zur Charakterisierung
von Chemikalienbibliotheken auf der Basis von
HPLC-UV/MS/CLND 709
Mario Arangio,
Razzano,
5.4.1 Einführung in die Problematik 709
5.4.2 Material und Methoden 710
5.4.2.1 Instrumentierung 710
5.4.2.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 710
5.4.2.3 Aufbau der Hochdurchsatz-Plattform (HTPl) 712
5.4.2.4 Chromatographische Einstellungen 713
5.4.2.5 Massenspektrometer- und CLND-Einstellungen 713
5.4.2.6 Datenverarbeitung und Registrierung 713
5.4.2.7 Multilineare Regressionsanalyse zur Ableitung des CLND-
Response-Faktors 715
5.4.3 Ergebnisse und Diskussion 716
5.4.3.1 Flüssigkeitschromatographie und
5.4.3.2 Entwicklung der Massenspektrometrie-Methode 717
5.4.3.3 CLND-Detektoreinstellung 717
5.4.3.4 Überprüfung mit kommerziellen Standards 717
5.4.3.5 Testen von eigenen Verbindungen 720
5.4.4 Zusammenfassung 724
Literatur 725
Anhang 727
Stichwortverzeichnis 753
|
| adam_txt |
VII
Inhaltsverzeichnis
Vorwort
Autorenverzeichnis
Zum Aufbau des Buches XXVII
1 Grundsätzliches zur Optimierung 1
1.1 Grundsätze der Optimierung in der HPLC am Beispiel der
RP-Chromatographie 3
Stavros Kromidas
1.1.1 Vor den ersten Optimierungsschritten 3
1.1.2 Was heißt eigentlich „Optimierung"? 6
1.1.3 Verbesserung der Auflösung („besser trennen") 6
1.1.3.1 Prinzipielle Möglichkeiten zur Verbesserung der Auflösung 8
1.1.3.2 Was „bringt" das meiste? 10
1.1.3.3 Welche Reihenfolge der Maßnahmen ist bei Optimierungsversuchen
sinnvoll? 12
1.1.3.4 Wie ändere ich k,
1.1.3.4.1 Isokratischer Modus 18
1.1.3.4.2 Gradientenmodus 29
1.1.3.4.3 Acetonitril oder Methanol? 20
1.1.4 Überprüfung der Peakhomogenität - das Drei-Stufen-Modell 22
1.1.5 Unbekannte Probe - wie soll ich anfangen? Strategien und
Konzepte 36
1.1.5.1 Die .¿-Tage-Methode" 37
1.1.5.2 „Das S-Schritte-Modell" 41
1.1.6 Verkürzung der Analysendauer („schneller trennen") 50
1.1.7 Empfindlichkeit erhöhen („mehr sehen", d. h. Nachweisgrenze
erniedrigen) 52
1.1.8 Ökonomie in der HPLC („billiger trennen") 52
1.1.9 Abschlussbemerkungen und Ausblick 54
Literatur 61
HPLC richtig optimiert: Ein Handbuch ßr Praktiker. Herausgegeben von
Copyright © 2006 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
ISBN: 3-527-31470-9
VIII
1.2 Schnelle Gradienten 63
Uwe Dieter Neue, Yung-Fong
1.2.1 Einleitung 63
1.2.2 Hauptteil 63
1.2.2.1 Theorie 63
1.2.2.2 Ergebnisse 65
1.2.2.2.1 Generelles 65
1.2.2.2.2 Kurze Säulen, Meine Teilchen 67
1.2.2.2.3 Ein konkretes Beispiel 69
1.2.2.3 Optimale Flussraten und Grenzen der heutigen Technologie 70
1.2.2.4 Apparative Schwierigkeiten und Lösungen 71
1.2.2.4.1 Umgehung des Gradientenverweilvolumens 71
1.2.2.4.2 Zeitkonstante und Datenaufhahmerate 73
1.2.2.4.3 Messung der Ionenunterdrückung mithilfe der Nachsäulen¬
infusion 73
Literatur 75
13 Selektivitätsänderung in der RP-HPLC mithilfe des pH-Wertes 77
Uwe Dieter Neue, Alberto
1.3.1 Einleitung 77
1.3.2 Hauptteil 77
1.3.2.1 Ionisierung und pH 77
1.3.2.2 Mobile Phase und pH-Wert 79
1.3.2.2.1 Pufferkapazität 81
1.3.2.2.2 Änderung von pK- und pH-Werten durch den Zusatz des
organischen Lösungsmittels 82
1.3.2.3 Puffer 85
1.3.2.3.1 Klassische Puffer 85
1.3.2.3.2 MS-kompatible pH-Wert-Kontrolle 85
1.3.2.4 Einfluss der Proben auf die Retention 86
1.3.2.4.1 Der Probentyp: Säuren, Basen, Zwitterionen 86
1.3.2.4.2 Der Einfluss des organischen Lösungsmittels auf die Ionisierung
der Proben 87
1.3.3 Anwendungsbeispiel 88
1.3.4
1.3.4.1 Reproduzierbarkeitsprobleme 92
1.3.4.2 Pufferstärke und Löslichkeit 92
1.3.4.3 Konstante Pufferkonzentration 93
1.3.5 Ausblick 93
Literatur 94
Inhaltsverzeichnis
1.4 Auswahl des richtigen pH-Wertes in der HPLC 95
Michael McBrien
(Übersetzung aus dem Englischen von Sven Fischer)
1.4.1 Einleitung 95
1.4.2 Typische Vorgehensweisen zur Wahl des pH-Wertes 96
1.4.3 Auswahl des Anfangs-pH-Wertes 97
1.4.4 Grundlage für die Vorhersage/Berechnung eines piCs-Wertes 98
1.4.5 Korrektur des pH-Wertes aufgrund des organischen Anteils im
Eluenten 99
1.4.6 Optimierung des pH-Wertes der mobilen Phase ohne Kenntnis
der chemischen Struktur der Analyte 102
1.4.7 Eine systematische Vorgehensweise zur Auswahl des pH-Wertes 103
1.4.8 Beispiel: Trennung von M-Bistß-pyriden^-ylethylJthiolbutan-
2,3-diol von seinen Verunreinigungen 104
1.4.9 Fehlersuche beim pH-Wert der mobilen Phase 109
1.4.10 Ein Blick in die Zukunft 110
1.4.11 Zusammenfassung HO
Literatur 111
1.5 Optimierung der Auswertung in der Chromatographie 113
Hans-Joachim
1.5.1 Auswertung und Bewertung chromatographischer Daten -
eine Einführung 113
1.5.2 Arbeitsbereich 113
1.5.3 Interner Standard 114
1.5.4 Kalibrierung 115
1.5.5 Lineare Regression 116
1.5.6 Wichtungsexponent 118
1.5.7 In der Praxis 120
1.5.8 Pharmaanalytik 120
1.5.9 Messunsicherheit 121
1.5.10 Nullpunktsgerade 123
Literatur 124
1.6 Gütekennwerte der Kalibration und Messunsicherheit als
Indikatoren für Optimierungspotenzial 225
Stefan Schömer
1.6.1 Optimierung der Kalibration - was ist das Ziel? 125
1.6.2 Der zentrale Gütekennwert einer Kalibration 126
1.6.3 Beispiele 126
1.6.3.1 Bedeutet eine höhere Empfindlichkeit auch eine bessere Methode? 126
1.6.3.2 Ist ein konstanter Variationskoeffizient gut oder schlecht -
oder einfach unvermeidbar? 130
XI
1.6.3.3 Matrixeffekte nachweisen - ist die Wiederfmdungsfunktion
ersetzbar? 140
1.6.3.4 Matrixeffekte nachgewiesen - ist ein Aufstockverfahren immer
notwendig? 143
1.6.3.5 Der Linearitätstest -
1.6.3.6 Richtigkeit optimieren - robuste Kalibrationsfunktion
mit Gewichtung ermitteln 150
Literatur 154
2 Die
2.1 RP-HPLC 157
2.1.1 Säulenvergleich und-auswahl in der RP-HPLC 157
Stavros Kromidas
2.1.1.1 Einleitung 157
2.1.1.2 Gründe für die Vielfalt von kommerziellen RP-Säulen -
erste Konsequenzen 157
2.1.1.2.1 Über polare Wechselwirkungen 162
2.1.1.2.2 Erste Konsequenzen 162
2.1.1.3 Kriterien zum Vergleich von RP-Phasen 181
2.1.1.3.1 Ähnlichkeit über die physikalisch-chemischen Eigenschaften 181
2.1.1.3.2 Ähnlichkeit über das chromatographische Verhalten,
Aussagekraft von Retentions- und Selektivitätsfaktoren 181
2.1.1.3.3 Tests zum Vergleich von Säulen und deren Aussagekraft 188
2.1.1
2.1.1.4.1 Selektivitätskarten 203
2.1.1.4.2 Selektivitätsplots 207
2.1.1.4.3 Selektivitätshexagone 212
2.1.1.4.4 Chemometrische Analyse der chromatographischen Daten 236
2.1.1.5 Eignung von RP-Phasen für bestimmte Analyttypen und Vorschläge
zur Säulenauswahl 241
2.1.1.5.1 Polare und hydrophobe RP-Phasen 241
2.1.1.5.2 Eignung von RP-Phasen für bestimmte Substanzklassen 245
2.1.1.5.3 Vorschläge zur Säulenauswahl 256
Literatur 261
2.1.2 Grundlagen der Selektivität von RP-Säulen 262
Uwe Dieter Neue,
2.1.2.1 Einleitung 262
2.1.2.2 Hauptteil 263
2.1.2.2.1 Hydrophobie und Silanolgrappenaktivität (Ionenaustausch) 263
2.1.2.2.2 Polare Wechselwirkungen (Wasserstoffbrückenbindung) 268
2.1.2.2.3 Reproduzierbarkeit der Selektivität 269
Literatur 271
Inhaltsverzeichnis
2.1.3 Charakterisierung von Umkehrphasen in der Flüssigkeits¬
chromatographie mittels Hauptkomponentenanalyse 272
Melvin R. Euerby und
(Übersetzung aus dem Englischen von Ulrich Panne)
2.1.3.1 Einleitung 272
2.1.3.2 Theorie der Hauptkomponentenanalyse 273
2.1.3.3 PCA der Datenbank mit RP-Kieselgel-Materialien 275
2.1.3.3.1 PCA von „polar
mit erhöhter polarer Selektivität 277
2.1.3.3.2 PCA von perfluorierten Phasen 278
2.1.3.4 PCA zur Identifizierung der Ähnlichkeit/Äquivalenz von Säulen und
Phasen 279
2.1.3.5 PCA für eine systematische Auswahl von stationären Phasen für die
Methodenentwicklung 286
2.1.3.5.1 Optimierungsstrategie für Eluent und stationäre Phase 287
Literatur 288
2.1.4 Chemometrie - ein geeignetes Werkzeug für die Verarbeitung von
großen Datensätzen 289
Cinzia
(Übersetzung aus dem Englischen von Ulrich Panne)
2.1.4.1 Einleitung 289
2.1.4.2 Chromatographische Tests und ihre Bedeutung für die Auswahl
der Trennsäule 289
2.1.4.3 Der Einsatz der Hauptkomponentenanalyse (PCA) für die Bewertung
und Auswahl von Testverbindungen 290
2.1.4.3.1 Physikochemische Eigenschaften der Testverbindungen 290
2.1.4.3.2 Chromatographische Eigenschaften der Testverbindungen 293
2.1.4.4 Der Einsatz der Hauptkomponentenanalyse (PCA) für die
Beurteilung von chromatographischen Trägermaterialien 294
2.1.4.4.1 Bewertung der stationären Phasen mit Phosphatpuffer
bei pH 7,0 als mobiler Phase 296
2.1.4.4.2 Bewertung der chromatographischen Phasen mit Phosphatpuffer
bei pH 3,0 als mobiler Phase 298
2.1.4.5 Optimierung eines chromatographischen Verfahrens durch
Chemometrie 300
2.1.4.5.1 Tesrverbindungen 300
2.1.4.5.2 Mobile Phasen 301
2.1.4.5.3 Chromatographische Parameter und Vergleichspräzision
der Chargen und Trennsäulen 302
2.1.4.6 Zusammenfassung und Ausblick 304
Literatur 305
Xlii Inhaltsverzeichnis
2.1.5 Lineare Freie Enthalpiebeziehungen (LFER) - Werkzeuge zur
Säulencharakterisierung und Methodenoptimierung? 306
Frank Steiner
2.1.5.1 Charakterisierung und Auswahl stationärer Phasen für die HPLC 306
2.1.5.2 Was sind LFER und warum sind sie für die HPLC von
Bedeutung? 307
2.1.5.3 Der Weg zu molekularen Deskriptoren für die multivariate
Regression 310
2.1.5.4 Beispiel für eine LFER-Prozedur mittels der Solvatationsgleichung 311
2.1.5.4.1 Vergleich stationärer Phasen basierend auf LFER-Parametern 311
2.1.5.4.2 Beschreibung des Einflusses der mobilen Phase mit
LFER-Regressionsparametern 318
2.1.5.4.3 Die Vorhersagbarkeit von Selektivitäten mittels LFER-Parametem 320
2.1.5.5 Empirischer Ansatz zur Bestimmung von Analytdeskriptoren
(und Phasenparametern) mittels HPLC 322
2.1.5.5.1 Das Prinzip im Unterschied zur Strategie mit vorgegebenen
Deskriptoren 322
2.1.5.5.2 Die experimentelle Durchführung 323
2.1.5.5.3 Bestimmung der fünf LFER-Parameter - eine Strategie in acht
Schritten 324
2.1.5.5.4 Variation der Elutionsbedingungen 327
2.1.5.5.5 Phasencharakterisierung mittels empirischer LFER-Parameter 330
2.1.5.6 Abschließende Betrachtung zur LFER-Anwendung in der HPLC 332
Literatur 333
2.1.6 Säulenselektivität von RP-Säulen 334
L R.
(Übersetzung aus dem Englischen von Hans-Joachim
2.1.6.1 Einleitung 334
2.1.6.2 Das
2.1.6.3 Anwendungen 340
2.1.6.3.1 Auswahl äquivalenter Säulen [18] 340
2.1.6.3.2 Auswahl von Säulen mit sehr unterschiedlicher Selektivität 344
2.1.6.4 Fazit 345
Nomenklatur 346
Literatur 347
2.1.7 Selektivität verstehen durch Suspended-State-High-Resolution-
Magic-Angle-Spinning NMR-Spektroskopie 348
Urban Skogsberg,
2.1.7.1 Einführung 348
2.1.7.2 Ist der Vergleich zwischen NMR und HPLC zulässig? 352
2.1.7.3 Der transfer-Nuclear-Overhauser-Effekt (trNOE) 355
Inhaltsverzeichnis
2.1.7.4
2.1.7.5 Wo finden die Wechselwirkungen statt? 359
2.1.7.6 Wasserstoffbrückenbindungen 360
2.1.7.7 Einige praktische Gesichtspunkte 360
2.1.7.8 Ausblick 362
Literatur 362
2.2 Optimierung in der Normalphasen-Chromatographie 363
Veronika R. Meyer
2.2.1 Einleitung 363
2.2.2 Eluenten in der NP-HPLC 364
2.2.3 Stationäre Phasen in der NP-HPLC 368
2.2.4
Weiterführende Literatur 371
2.3 Optimierung von GPC-Analysen durch geeignete Wahl von
stationärer Phase und Detektionsverfahren 373
Peter KHz
2.3.1 Einleitung 373
2.3.2 Grundlagen der
2.3.2.1 Trermmechanismen in der Säule 376
2.3.2.2 Kriterien zur Auswahl von GPC-Säulen und Optimierung
von
2.3.2.2.1 Auswahl von Porengröße und Trennbereich 379
2.3.2.2.2 Vor- und Nachteile von Linearsäulen 380
2.3.2.3 Hochgeschwindigkeits (HighSpeedJ-GPC-Trennungen 381
2.3.3 Umfassende Detektionsmöglichkeiten zur Aufklärung
makromolekularer Materialien 383
2.3.3.1 Anwendung informationsreicher Detektoren in der
Flüssigchromatographie 385
2.3.3.2 Analyse von Copolymeren mit Multidetektions-GPC 386
2.3.3.3 Simultane Trennung und Identifizierung durch GPC-FTIR-
Kopplung 390
2.3.3.4 Anwendung molmassensensitiver Detektoren in der GPC 392
2.3.3.4.1 Lichtstreudetektoren 392
2.3.3.4.2 GPC-Viskosimetrie-Kopplung 394
2.3.4 Zusammenfassung 395
Literatur 396
2.4 Gelfiltration - Größenausschluss-Chromatographie von
Biopolymeren - Optimierungsstrategien und Fehlersuche 397
M.
2.4.1 Ausgangssituation und gegenwärtige Trends 397
2.4.2 Spezifische, grandlegende Aspekte der
XIV
2.4.3 Vergleich der
2.4.4 Aspekte bei der Optimierung der
2.4.4.1 Säulenauswahl und optimale Flussrate 403
2.4.4.2 Optimierung der Fließmittelzusammensetzung 408
2.4.4.3 Probenvorbehandlung 420
2.4.4.4 Viskosität und Volumen der Probenlösung - zwei kritische
Parameter bei der Dosierung 410
2.4.4.5 Detektionsmethoden 411
2.4.5 Anwendungsfelder der
2.4.5.1 High Performance
2.4.5.2 Bestimmung des Molekulargewichtes 412
2.4.5.3 Die Gelfiltration als ein Werkzeug zum Studium von
Konformationsänderungen von Proteinen 413
2.4.5.4 Die Gelfiltration in der präparativen und Prozesschromatographie
(Down Stream
2.4.5.5 SEC-Säulen basierend auf dem Prinzip der eingeschränkten
Zugänglichkeit
der Proteomanalyse 415
Literatur 418
2.5 Optimierung in der Affinitätschromatographie 419
Egbert Müller
2.5.1 Einführung und Grundlagen der Affinitätschromatographie 419
2.5.2 Auswahl der Basismaterialien 423
2.5.3 Immobilisierungsmethoden 424
2.5.4 Aktivierungsmethoden 425
2.5.5
2.5.6 Gerichtete Immobilisierung 432
2.5.7 Nicht-partikuläre Affinitätsträger 433
2.5.8 Durchführung einer Affinitätsreinigung 434
2.5.9 Anwendung von mathematischen Optimierungsmethoden 436
2.5.10 Empfehlungen zur Immobilisierung in Kurzform 441
Literatur 442
2.6 Optimierung von Enantiomerentrennungen in der HPLC* 445
Markus Juza
2.6.1 Einleitung 445
2.6.2 Grundlegende Prinzipien der enantioselektiven HPLC 445
2.6.2.1 Thermodynamische Grundlagen der enantioselektiven HPLC 448
2.6.2.2 Adsorption und chirale Erkennung 449
2.6.2.3 Unterschiede zur RP- und NP-HPLC 451
2.6.2.4 Grundsätzliches zur Optimierung enantioselektiver HPLC-
Trennungen 452
2.6.3 Selektoren und stationäre Phasen 452
Inhaltsverzeichnis
2.6.4 Methodenwahl und Optimierung 460
2.6.4.1
2.6.4.2 Immobilisierte
2.6.4.3 Tartratphasen 464
2.6.4.4 TC-Acide und n-basische stationäre Phasen 464
2.6.4.5 Makrocyclische Selektoren, Cyclodextrine und Antibiotika 466
2.6.4.6 Proteine und
2.6.4.7 Rutheniumkomplexe 470
2.6.4.8 Synthetische und
2.6.4.9 Metallkompexierungs- und Ligandenaustauschphasen 471
2.6.4.10 Chirale Ionentauscher 471
2.6.5 Fehlervermeidung und
2.6.5.1 Geräte und Säulen - praktische Tipps 472
2.6.5.2 Detektion 473
2.6.5.3 Fehlerquellen aus dem Analyten 473
2.6.6 Präparative enantioselektive HPLC 475
2.6.6.1 Bestimmung der Beladung 476
2.6.6.2 Bestimmung der Elutionsvolumina und der Flussrate 476
2.6.6.3 Enantiomerentrennungen mittels
Chromatography (SMB)
2.6.6.3.1 Prinzip der
2.6.6.3.2 Kommerzielle Wirkstoffe, die mittels SMB getrennt werden 480
2.6.7
mobilen Phase in HPLC und Kapillarelektrophorese 480
2.6.8 Bestimmung der Enantiomerenreinheit durch Bildung von
Diastereomeren 482
2.6.9 Indirekte Enantiomerentrennung im präparativen Maßstab 483
2.6.10 Enantiomerentrennung unter superkritischen chromatographischen
Bedingungen (SFC) 483
2.6.11 Neue chirale stationäre Phasen und Informationssysteme 484
2.6.12 Fazit 484
Literatur 485
2.7 Miniaturisierung 487
2.7.1 uLC/Nano-LC - Optimierungsmöglichkeiten und Fehlervermeidung
aus Anwendersicht 487
Jürgen Maier-Rosenkranz
2.7.1.1 Einleitung 487
2.7.1.2 Empfindlichkeit - wie kann ich sie erhöhen? 487
2.7.1.2.1 Einfluss der Säulenlänge 487
2.7.1.2.2 Einfluss des Säuleninnendurchmessers 487
2.7.1.2.3 Einfluss der stationären Phase 489
2.7.1.3 Robustheit 489
2.7.1.3.1 Systemauswahl 489
XVI
2.7.1.3.2 Kapillarverbindungen 492
2.7.1.3.3 Maßnahmen gegen Verstopfen 497
2.7.1.3.4 Lecksuche 498
2.7.1.3.5 Vorsäulenschaltungen - Probenauftragsstrategien 499
2.7.1.4 Empfindlichkeit/Auflösung 504
2.7.1.4.1 Säulendimensionierung 504
2.7.1.4.2 Packmaterial/Belegungstypen 505
2.7.1.4.3 Detektoren 505
Literatur 507
2.7.2 Mikrochip-basierte Flüssigchromatographie -
Techniken und Möglichkeiten 508
Jörg P. Kutter
2.7.2.1 Einführung in die Thematik 508
2.7.2.2 Verschiedene Techniken 509
2.7.2.2.1 Druckgetriebene Flüssigchromatographie (LC) 509
2.7.2.2.2
2.7.2.2.3 Elektrochromatographie in gepackten Kanälen 510
2.7.2.2.4 Labyrinth-artige
der stationären Phase
2.7.2.2.5 In situ polytnerisierte monolithische stationäre Phasen 511
2.7.2.3 Optimierung der Systeme und ihre Potenziale 511
2.7.2.3.1 Trennleistung 511
2.7.2.3.2 Isokratische- und Gradientelution 5J2
2.7.2.3.3 Maßgeschneiderte stationäre Phasen 513
2.7.2.3.4 Kopplung auf dem Mikrochip zur integrierten Probenvorbereitung
und mehrdimensionalen Trennung 514
2.7.2.3.5 Schwierigkeiten und Herausforderungen 514
2.7.2.4 Anwendungsbeispiele 515
2.7.2.5 Abschließende Bewertung und Ausblick 518
Literatur 519
2.7.Í
Uwe D. Neue, Eric S. Crumbach, Marianna Kele, Jeffrey R. Mazzeo
und Dirk Sievers
2.7.3.1 Einführung 520
2.7.3.2 Isokratische Trennungen 521
2.7.3.3 Gradiententrennungen 524
2.7.3.4 Fazit 528
Literatur 528
Inhaltsverzeichnis
3 Kopplungstechniken 529
3.1 Immunchromatographische Kopplungen 53 /
Michael C. Weller
3.1.1 Hinführung 53/
3.1.2 Bindungsmoleküle 531
3.1.3 hntiuinoassays 533
3.1.4 Initnunchromatographisclie Techniken 533
3.1.4.1 Affinitätsanreichenmg
3.1.4.2 Hellte Affinitätsehromatographie
(„Weak Affinity
3.1.4.
5.1.
3.1.5.1 Beispiel 1: Affinitätsextraktion
3.1.5.2 Beispiel 2:
3.1.5.3 Beispiel*: Biochemische Detektion 547
Literatur
3.2 Erweiterte Charakterisierungs- und Analysemöglichkeiten
durch 2-dimensionale Chromatographie 549
Peter KHz
3.2.1 Einleitung 549
\.l.2
Ї.ІЛ
3.2.4 Stand der Technik in der
Í.2.J
Literatur 562
3.3 LC-M
Friedrich Mandel
3.3.1 Optimieren des lonisationsprozesses 563
3.3.2 Verschwundene
3.3.2.1 Grenzweniger pH-Wert der mobilen Phase 565
3.3.2.2 lonenpaarbildnerim HPLC-System 565
Î.
Probenmatrix oder Kontaminantien 566
3.3.3 Wie sauber
Ì3A
L xeroxe
XVIII Inhaltsverzeichnis
3.4 LC-NMR-Kopplung 573
Klaus Albert, Manfred Krucker, Marc David Grynbaum und
Karsten Putzbach
ЗАЛ
3.4.2 Empfindlichkeit des NMR-Experimentes 574
3.4.3 NMR-Spektroskopie in fließenden Systemen 575
3.4.4 NMR-Messköpfe zur LC-NMR-Kopplung 575
3.4.5 Praktische Durchführung der analytischen HPLC-NMR-Kopplung
und der Kapillar-HPLC-NMR-Kopplung 576
3.4.6 Durchfluss-Messungen 577
3.4.7 Stopped-Flow-Messverfahren 580
3.4.8 Kapillartrennungen 581
3.4.9 Ausblick 583
Literatur 586
4 Computer-unterstützte Optimierung 587
4.1 Computer-unterstützte HPLC-Methodenentwicklung mit der
DryLab®-Software 589
Lloyd R. Snyder und Loren Wrisley
(Übersetzung aus dem Englischen von Christine
4.1.1 Einleitung 589
4.1.1.1 Rückblick 591
4.1.1.2 Theorie 592
4.1.2 Die Möglichkeiten von DryLab 592
4.1.2.1 Die Funktionsweise von DryLab 592
4.1.2.2 Modus-Auswahl 593
4.1.3 Praktische Anwendungen von DryLab im Labor 594
4.1.4 Zusammenfassung und Ausblick 608
Literatur 609
4.2 ChromSwordfSj-Software
unterstützte HPLC-Methodenentwicklung 611
S. Calushko,
4.2.1 Einführung 611
4.2.1.1 Offline-Modus 631
4.2.1.2 Online-Modus 611
4.2.2 ChromSword®-Versionen 611
4.2.3 Anbindung eines HPLC-Systems im Online-Modus 612
4.2.4 Methodenentwicklung mit ChromSword® 613
4.2.4.1 Offline-Modus (Computer-unterstützte Methodenentwicklung) 623
4.2.4.2 Online-Modus - vollautomatische Optimierung von isokratischen
und Gradienten-Trennungen 617
Inhaltsverzeichnis XIX
4.2.4.2.1 Software-Funktionen für die Automatisierung 622
4.2.4.2.2 Wie optimiert das System HPLC-Trennungen? 622
4.2.5 Fazit 625
Literatur 626
4.3 Multifaktorielle systematische Methodenentwicklung
und -Optimierung in der Umkehrphasen-HPLC 627
Michael Pfeffer
4.3.1 Einleitung und
4.3.2 Strategie für teilautomatisierte Methodenentwicklungen 630
4.3.3 Vergleich kommerziell erhältlicher Software im Hinblick auf den
Beitrag zur
4.3.4 Entwicklung eines neuen Systems zur multifaktoriellen
Methodenentwicklung 636
4.3.4.1 Auswahl stationärer Phasen 637
4.3.4.2 Methodenoptimierung mit HEUREKA 639
4.3.4.3 Auswertung der Daten mit HEUREKA 645
4.3.5 Fazit und Ausblick 650
Literatur 650
5 „Anwender berichten" 652
5.1 Nano-LC-MS/MS in der Proteomforschung 653
Heike Schäfer, Christiane Lohaus, Helmut E. Meyer und Katrin Marcus
5.1.1 Proteomforschung - eine Einführung in die Thematik 653
5.1.2 Probenvorbereitung für die Nano-LC 654
5.1.3 Nano-LC 655
5.1.4 Online-LC-ESI-MS/MS-Kopplung 660
5.1.5 Offline-LC-MALDI-MS/MS-Kopplung 661
5.1.5.1 Probenfraktionierung 661
5.1.5.2 MALDI-TOF-MS/MS-Analysen 663
5.1.6 Datenanalyse 663
5.1.7 Anwendungsbeispiel: Analyse des a-Crystallin
der Maus 664
Literatur 667
5.2 Wege zur Überprüfung der Robustheit in der RP-HPLC 669
Hans Büke
5.2.1 Zur Überprüfung der Robustheit 669
5.2.2 Robustheitstest in der analytischen RP-HPLC mittels systematischer
Methodenentwicklung 669
5.2.3 Robustheitstest in der analytischen RP-HPLC mittels statistischer
Versuchsplanung (DoE) 679
Literatur 693
XX
5.3 Trennung komplexer Proben 695
Knut Wagner
5.3.1 Einleitung 695
5.3.2 Mehrdimensionale HPLC 695
5.3.3 Techniken der mehrdimensionalen Trennung 697
5.3.3.1 Offline-Technik 697
5.3.3.2 Online-Technik 698
5.3.4 Online Probenvorbereitung als Vorstufe der mehrdimensionalen
HPLC 699
5.3.5 Anwendungsgebiet der mehrdimensionalen HPLC 702
5.3.5.1 Was ist realisierbar? - ein Beispiel aus der Praxis 702
5.3.6 Kritische Parameter der mehrdimensionalen HPLC 707
Literatur 708
5.4 Evaluierung eines integrierten Verfahrens zur Charakterisierung
von Chemikalienbibliotheken auf der Basis von
HPLC-UV/MS/CLND 709
Mario Arangio,
Razzano,
5.4.1 Einführung in die Problematik 709
5.4.2 Material und Methoden 710
5.4.2.1 Instrumentierung 710
5.4.2.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 710
5.4.2.3 Aufbau der Hochdurchsatz-Plattform (HTPl) 712
5.4.2.4 Chromatographische Einstellungen 713
5.4.2.5 Massenspektrometer- und CLND-Einstellungen 713
5.4.2.6 Datenverarbeitung und Registrierung 713
5.4.2.7 Multilineare Regressionsanalyse zur Ableitung des CLND-
Response-Faktors 715
5.4.3 Ergebnisse und Diskussion 716
5.4.3.1 Flüssigkeitschromatographie und
5.4.3.2 Entwicklung der Massenspektrometrie-Methode 717
5.4.3.3 CLND-Detektoreinstellung 717
5.4.3.4 Überprüfung mit kommerziellen Standards 717
5.4.3.5 Testen von eigenen Verbindungen 720
5.4.4 Zusammenfassung 724
Literatur 725
Anhang 727
Stichwortverzeichnis 753 |
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