Zytostatikaresistenz in Weichteilsarkomzellen:
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2005
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis 6
Abkürzungen 7
1 Einleitung 10
1.1 Weichteilsarkome 10
1.2 Wirkungsmechanismus der Chemotherapie 11
1.3 Bedeutung der Hyperthermie zur Wirkungsverstärkung der Chemotherapie 14
1.4 Fragestellungen der Arbeit 16
2 Material und Methoden 17
2.1 Material 17
2.1.1 Allgemeine Laborgeräte 17
2.1.2 Plastikwaren 17
2.1.3 Peptide 18
2.1.4 Zellkultur 18
2.1.5 Durchflußzytometrie 19
2.1.6 Fluoreszenzmessungen 19
2.1.7 Western Blot 19
2.1.8 Sonstige Materialien 20
2.2 Methoden 21
2.2.1 Zellkulturverfahren 21
2.2.2 Apoptoseinduktion 21
2.2.2.1 Zytostatikabehandlung 21
2.2.2.2 In vitro Hyperthermieapplikation 22
2.2.2.3 Auswertung der Apoptoseinduktion 22
2.2.3 Durchflußzytometrie 23
2.2.3.1 Annexin V-FITC-Assay 24
2.2.3.1.1 Durchführung 24
2.2.3.1.2 Auswertung 25
2.2.3.2 Caspase-Inhibition 26
4
2.2.3.2.1 Durchführung 26
2.2.3.2.2 Auswertung 27
2.2.4 Caspase-3 Aktivitätsmessung 27
2.2.4.1 Durchführung 27
2.2.4.2 Auswertung 28
2.2.5 Proteinchemische Verfahren 28
2.2.5.1 Proteinextraktion 28
2.2.5.2 Proteinbestimmung 28
2.2.5.3 SDS-Page/Gelelektrophorese 29
2.2.5.4 Proteinnachweis im Western-Blot 30
2.2.6 Untersuchungen zum Einfluß von Smac (Second mitochondria-derived
activator of caspases) 31
2.2.6.1 Durchfuhrung 31
2.2.6.2 Auswertung 31
2.3 Statistische Auswertung der Versuchsergebnisse 32
3 Ergebnisse 33
3.1 Zytotoxische Effekte von Melphalan und/oder Hyperthermie auf TE-671 Zellen 33
3.2 Zeitkinetik der Melphalan- und Hyperthermie-induzierten Zytotoxizität 34
3.3 Bedeutung der Caspasenaktivierung bei der Melphalan- und Hyperthermie-
induzierten Zytotoxizität 35
3.4 Nachweis von XIAP 37
3.5 Wirkung von Smac-Peptiden auf die Melphalan-induzierte Zytotoxizität 38
4 Diskussion 40
4.1 Zytostatika-vermittelte Apoptoseinduktion in Tumorzellen - Bedeutung der
gleichzeitigen Anwendung von Wärme und Zytostatika 40
4.2 Mechanismen der Resistenz gegen Melphalan in TE-671 Zellen 41
5 Zusammenfassung der Arbeit 45
Literatur 47
Anlagen 58
5
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Vereinfachte Darstellung der wichtigsten Signalwege der Apoptoseinduktion 13
Abb. 2: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufes der Zeitkinetikexperimente 22
Abb. 3: Biparametrisches Dotplot-Diagramm 25
Abb. 4: Aufbau eines Semi-Dry-Western-Blots nach Kyhse-Andersen 30
Abb. 5: Zytotoxische Effekte von Melphalan und/oder Hyperthermie auf TE-671 Zellen 33
Abb. 6: Zeitkinetik der Melphalan- und Hyperthermie-induzierten Zytotoxizität 34
Abb. 7: Einfluß der Caspaseninhibition auf die Melphalan- und Hyperthermie induzierte
Zytotoxizität 36
Abb. 8: Caspase-3 Aktivierung durch Melphalan und Hyperthermie in TE-671 Zellen 37
Abb. 9: XIAP-Proteinnachweis mittels Western-Blot Analyse in TE-671 Zellen 38
Abb. 10: Einfluß von Smac-Peptiden auf die Melphalan-induzierte Zytotoxizität 39
6
|
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Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis 6
Abkürzungen 7
1 Einleitung 10
1.1 Weichteilsarkome 10
1.2 Wirkungsmechanismus der Chemotherapie 11
1.3 Bedeutung der Hyperthermie zur Wirkungsverstärkung der Chemotherapie 14
1.4 Fragestellungen der Arbeit 16
2 Material und Methoden 17
2.1 Material 17
2.1.1 Allgemeine Laborgeräte 17
2.1.2 Plastikwaren 17
2.1.3 Peptide 18
2.1.4 Zellkultur 18
2.1.5 Durchflußzytometrie 19
2.1.6 Fluoreszenzmessungen 19
2.1.7 Western Blot 19
2.1.8 Sonstige Materialien 20
2.2 Methoden 21
2.2.1 Zellkulturverfahren 21
2.2.2 Apoptoseinduktion 21
2.2.2.1 Zytostatikabehandlung 21
2.2.2.2 In vitro Hyperthermieapplikation 22
2.2.2.3 Auswertung der Apoptoseinduktion 22
2.2.3 Durchflußzytometrie 23
2.2.3.1 Annexin V-FITC-Assay 24
2.2.3.1.1 Durchführung 24
2.2.3.1.2 Auswertung 25
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4
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2.2.4 Caspase-3 Aktivitätsmessung 27
2.2.4.1 Durchführung 27
2.2.4.2 Auswertung 28
2.2.5 Proteinchemische Verfahren 28
2.2.5.1 Proteinextraktion 28
2.2.5.2 Proteinbestimmung 28
2.2.5.3 SDS-Page/Gelelektrophorese 29
2.2.5.4 Proteinnachweis im Western-Blot 30
2.2.6 Untersuchungen zum Einfluß von Smac (Second mitochondria-derived
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2.2.6.1 Durchfuhrung 31
2.2.6.2 Auswertung 31
2.3 Statistische Auswertung der Versuchsergebnisse 32
3 Ergebnisse 33
3.1 Zytotoxische Effekte von Melphalan und/oder Hyperthermie auf TE-671 Zellen 33
3.2 Zeitkinetik der Melphalan- und Hyperthermie-induzierten Zytotoxizität 34
3.3 Bedeutung der Caspasenaktivierung bei der Melphalan- und Hyperthermie-
induzierten Zytotoxizität 35
3.4 Nachweis von XIAP 37
3.5 Wirkung von Smac-Peptiden auf die Melphalan-induzierte Zytotoxizität 38
4 Diskussion 40
4.1 Zytostatika-vermittelte Apoptoseinduktion in Tumorzellen - Bedeutung der
gleichzeitigen Anwendung von Wärme und Zytostatika 40
4.2 Mechanismen der Resistenz gegen Melphalan in TE-671 Zellen 41
5 Zusammenfassung der Arbeit 45
Literatur 47
Anlagen 58
5
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Vereinfachte Darstellung der wichtigsten Signalwege der Apoptoseinduktion 13
Abb. 2: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufes der Zeitkinetikexperimente 22
Abb. 3: Biparametrisches Dotplot-Diagramm 25
Abb. 4: Aufbau eines Semi-Dry-Western-Blots nach Kyhse-Andersen 30
Abb. 5: Zytotoxische Effekte von Melphalan und/oder Hyperthermie auf TE-671 Zellen 33
Abb. 6: Zeitkinetik der Melphalan- und Hyperthermie-induzierten Zytotoxizität 34
Abb. 7: Einfluß der Caspaseninhibition auf die Melphalan- und Hyperthermie induzierte
Zytotoxizität 36
Abb. 8: Caspase-3 Aktivierung durch Melphalan und Hyperthermie in TE-671 Zellen 37
Abb. 9: XIAP-Proteinnachweis mittels Western-Blot Analyse in TE-671 Zellen 38
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