Molekulargenetische Untersuchungen zur autosomal rezessiven proximalen spinalen Muskelatrophie (SMA):
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2005
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Abkürzungen... « 1
2. Einleitung. 2
2.1 Klinische Merkmale der proximalen spinalen Muskelatrophie (SMA)....2
2.2 Molekulare Grundlagen der SMA 4
2.2.1 Molekulargenetik der SMA 4
2.2.2 Veränderungen auf RNA-Ebene 9
2.2.3 Veränderungen auf Protein-Ebene 9
2.2.4 Möglichkeiten der molekulargenetischen Diagnostik 12
2.2.5 Mausmodelle der spinalen Muskelatrophie 13
2.2.6 Der Pathomechanismus der spinalen Muskelatrophie 14
2.3 Therapieansätze 15
2.4 Zielsetzung und Inhalt der Arbeit 17
3. Material und Methoden 19
3.1 Patientenkollektiv 19
3.2 Materialien 19
3.2.1 Chemikalien 19
3.2.2 Enzyme 19
3.2.3 Nukleotide, Nukleinsäuren und Längenstandards 20
3.2.4 Vektorsysteme 20
3.2.5 Kits 20
3.2.6 Primer 20
3.3 Methoden 21
3.3.1 Isolierung und Aufbereitung menschlicher DNA 21
3.3.2 Minipräparation von Plasmid-DNA 21
3.3.3 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung menschlicher DNA 22
3.3.4 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 23
3.3.5 Quantitative Genanalyse mit dem LightCycler 24
3.3.5.1 Bau- und Funktionsweise des LightCyclers 24
3.3.5.2 Fluoreszenzformate für die Echtzeit-PCR 26
3.3.5.3 Bestimmung der Kopienzahl des SMNl-Gens (Heterozygotentest) 29
3.3.5.4 Bestimmung der Kopienzahl des SMN2-Gens 30
3.3.6 Mutationsanalyse 31
3.3.6.1 Herstellung permanenter lymphoblastoider Zelllinien 33
3.3.6.2 RNA-Isolierung mit Trizol 34
3.3.6.3 RNA-Fällung 35
3.3.6.4 Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der RNA...35
3.3.6.5 Analytische RNA-Gelelektrophorese 36
3.3.6.6 Reverse Transkription von RNA in komplementäre DNA (cDNA-
Synthese) und Subklonierung der RT-PCR-Produkte 37
Schritt 1: Amplifizierung des SMN-Gens (RT-PCR) 37
Schritt 2: Aufreinigung der PCR-Produkte 38
Schritt 3: Subklonierung der RT-PCR-Produkte mit dem TOPO-TA-
Cloning-Kit 38
3.3.6.7 Sequenzierung 41
3.3.6.8 Auswertung der Sequenzen 43
3.3.6.9 Restriktionsverdau von Exon 2a mit Msel 43
3.3.7 Analyse des Polymorphismus in Exon 3 45
3.3.7.1 Nachweis durch enzymatischen Restriktionsverdau 45
3.3.7.2 Nachweis des alternativen Spleißens von Exon 3 46
3.3.7.3 Sequenzierung der Exon 3 flankierenden intronischen Bereiche 47
3.3.7.4 Statistische Auswertung 48
4. Ergebnisse 49
4.1 Bestimmung der SMN1 - und SMN2-Genverteilung bei Kontrollpersonen
(TeilA) 49
4.2 Punktmutationsanalyse bei SMA-Patienten (Teil B) 54
4.3 Untersuchungen zum Polymorphismus 495 G—»A in Exon 3 (Teil Q...58
5. Diskussion 68
5.1 Bestimmung der SMN1- und SMN2-Genverteilung bei Kontrollpersonen
68
5.2 Punktmutationsanalyse bei SMA-Patienten 72
5.3 Untersuchungen zum Polymorphismus 495 G—»A in Exon 3 74
6. Zusammenfassung 78
7. Literaturverzeichnis 80
8. Eigene Veröffentlichungen 98
9. Anhang 99
I Primerübersicht
II Tabellarische Übersicht über die in Teil C untersuchten Personen
10. Lebenslauf. 110
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Inhaltsverzeichnis
1. Abkürzungen. « 1
2. Einleitung. 2
2.1 Klinische Merkmale der proximalen spinalen Muskelatrophie (SMA).2
2.2 Molekulare Grundlagen der SMA 4
2.2.1 Molekulargenetik der SMA 4
2.2.2 Veränderungen auf RNA-Ebene 9
2.2.3 Veränderungen auf Protein-Ebene 9
2.2.4 Möglichkeiten der molekulargenetischen Diagnostik 12
2.2.5 Mausmodelle der spinalen Muskelatrophie 13
2.2.6 Der Pathomechanismus der spinalen Muskelatrophie 14
2.3 Therapieansätze 15
2.4 Zielsetzung und Inhalt der Arbeit 17
3. Material und Methoden 19
3.1 Patientenkollektiv 19
3.2 Materialien 19
3.2.1 Chemikalien 19
3.2.2 Enzyme 19
3.2.3 Nukleotide, Nukleinsäuren und Längenstandards 20
3.2.4 Vektorsysteme 20
3.2.5 Kits 20
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3.3 Methoden 21
3.3.1 Isolierung und Aufbereitung menschlicher DNA 21
3.3.2 Minipräparation von Plasmid-DNA 21
3.3.3 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung menschlicher DNA 22
3.3.4 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 23
3.3.5 Quantitative Genanalyse mit dem LightCycler 24
3.3.5.1 Bau- und Funktionsweise des LightCyclers 24
3.3.5.2 Fluoreszenzformate für die Echtzeit-PCR 26
3.3.5.3 Bestimmung der Kopienzahl des SMNl-Gens (Heterozygotentest) 29
3.3.5.4 Bestimmung der Kopienzahl des SMN2-Gens 30
3.3.6 Mutationsanalyse 31
3.3.6.1 Herstellung permanenter lymphoblastoider Zelllinien 33
3.3.6.2 RNA-Isolierung mit Trizol 34
3.3.6.3 RNA-Fällung 35
3.3.6.4 Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der RNA.35
3.3.6.5 Analytische RNA-Gelelektrophorese 36
3.3.6.6 Reverse Transkription von RNA in komplementäre DNA (cDNA-
Synthese) und Subklonierung der RT-PCR-Produkte 37
Schritt 1: Amplifizierung des SMN-Gens (RT-PCR) 37
Schritt 2: Aufreinigung der PCR-Produkte 38
Schritt 3: Subklonierung der RT-PCR-Produkte mit dem TOPO-TA-
Cloning-Kit 38
3.3.6.7 Sequenzierung 41
3.3.6.8 Auswertung der Sequenzen 43
3.3.6.9 Restriktionsverdau von Exon 2a mit Msel 43
3.3.7 Analyse des Polymorphismus in Exon 3 45
3.3.7.1 Nachweis durch enzymatischen Restriktionsverdau 45
3.3.7.2 Nachweis des alternativen Spleißens von Exon 3 46
3.3.7.3 Sequenzierung der Exon 3 flankierenden intronischen Bereiche 47
3.3.7.4 Statistische Auswertung 48
4. Ergebnisse 49
4.1 Bestimmung der SMN1 - und SMN2-Genverteilung bei Kontrollpersonen
(TeilA) 49
4.2 Punktmutationsanalyse bei SMA-Patienten (Teil B) 54
4.3 Untersuchungen zum Polymorphismus 495 G—»A in Exon 3 (Teil Q.58
5. Diskussion 68
5.1 Bestimmung der SMN1- und SMN2-Genverteilung bei Kontrollpersonen
68
5.2 Punktmutationsanalyse bei SMA-Patienten 72
5.3 Untersuchungen zum Polymorphismus 495 G—»A in Exon 3 74
6. Zusammenfassung 78
7. Literaturverzeichnis 80
8. Eigene Veröffentlichungen 98
9. Anhang 99
I Primerübersicht
II Tabellarische Übersicht über die in Teil C untersuchten Personen
10. Lebenslauf. 110 |
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