Mutationsanalyse im PTEN-Gen bei Patienten mit Verdacht auf Proteus Syndrom, hereditäres Mammakarzinom und Glioblastom mittels DHPLC und Direktsequenzierung:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2005
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Leipzig, Univ., Diss., 2005 |
| Beschreibung: | VIII, 113 Bl. graph. Darst. 30 cm |
Internformat
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Datensatz im Suchindex
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsliste I
Verzeichnis der Abbildungen V
Verzeichnis der Tabellen VII
1. Einleitung 1
1.1 Proteus Syndrom 1
1.2 Familiärer hereditärer Brustkrebs 3
1.2.1 Krebsentstehung 3
1.2.2 Brustkrebs 4
1.3 Glioblastom 6
1.4 PTEN-Gen 7
1.4.1 Darstellung 7
1.4.2 PTEN-Protein 8
1.4.3 Überblick über die Keimbahn- und somatischen Mutationen in PTEN 11
1.4.3.1 PTEN-Mutationen bei Proteus Syndrom 13
1.4.3.2 PTEN-Mutationen in familiärem hereditären Brustkrebs 13
1.4.3.3 PTEN-Mutationen im Glioblastom 15
1.5 Techniken zur Detektion von Sequenzvarianten des PTEN-Gens 15
1.5.1 Verlust von Heterozygotie 15
1.5.2 Mutationsnachweis 16
1.5.2.1 DHPLC 18
1.5.2.2 Direktsequenzierung 18
1.5.2.3 Computer-unterstützte Mutationsanalyse 19
1.6 Zielstellung 19
2 Material und Methoden 21
2.1 Untersuchungsmaterial 21
2.1.1 Patienten und Kontrollpersonen 21
Inhaltsverzeichnis
2.1.2 Technische Geräte 22
2.1.3 Chemikalien 22
2.1.3.1 Reagenzien 22
2.1.3.2 Stammlösungen und Puffer 23
2.1.3.3 Enzyme 23
2 13 4 Standards und Farbstoffe 24
2.1.3.5 Kits 24
2.1.3.6 Primer 24
2.1.4 Softwareprogramme, Datenbanken und Sequenzquellen 26
2.1.4.1 Software zum Primerdesign 26
2.1.4.2 Software zur Schmelzpunktbestimmung 26
2.1.4.3 ABI PRISM™ Software zur Sequenz-und Fragmentanalyse 26
2.1.4.4 Software zur statistischen Datenanalyse 26
2.1.4.5 Sequenz-und Mutationsdatenbanken (Online) 27
2.2 Methoden 27
2.2.1 DNA-Isolierung aus Vollblut und Tumorgewebe 27
2.2.2 Agarose-Gelelektrophorese 29
2.2.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) 30
2.2.3.1 Primerdesign 31
2.2.3.1.1 Mg2+-Konzentration im Reaktionsansatz 32
2.2.3.1.2 Annealingtemperatur 33
2.2.3.1.3 Elektrophorese der PCR-Produkte 33
2.2.4 Fragmentanalyse für den Nachweis von LOH und Mikrosatelliten- 33
instabilität
2.2.4.1 Mikrosatellitenmarker 34
2.2.4.2 PCR-Ansatz und -Programm 35
2.2.4.3 Vorbereitung zur Fragmentanalyse 36
2.2.4.4 Elektrophorese und Detektion der Fragmentanalyseprodukte im ABI 37
PRISM™ 377
2.2.4.4.1 Vorbereitung der Glasgeräte 37
Inhaltsverzeichnis
2.2.4.4.2 Gelherstellung 38
2.2.4.4.3 Elektrophorese der Fragmente 39
2.2.4.4.4 Fragmentanalyse 39
2.2.5 DHPLC-Analyse 40
2.2.5.1 Prinzip des Verfahrens 40
2.2.5.1.1 Säulenmaterial und Fließmittel 40
2.2.5.1.2 Temperaturmodulierende Heteroduplexanalyse (TMHA) 41
2.2.5.2 Vorbereitung des Systems zur Analyse 42
2.2.5.3 Probenvorbereitung 43
2.2.5.4 Puffer-Herstellung 43
2.2.5.5 Erstellung der Standardfließmittelgradienten 43
2.2.5.6 Theoretische und praktische Schmelzpunktbestimmung 44
2.2.5.7 Mutationsdetektion 45
2.2.6 Sequenzierung 47
2.2.6.1 Reinigung der PCR-Produkte 48
2.2.6.2 Sequenzierungsansatz und Programm 49
2.2.6.3 Fällung der Sequenzierungsprodukte 49
2.2.6.4 Gelherstellung 50
2.2.6.5 Elektrophorese der Sequenzierungsprodukte 51
2.2.6.6 Sequenzanalyse 52
2.2.7 Kotrolluntersuchungen 52
2.2.8 Statistische Datenanalyse 53
3. Ergebnisse 54
3.1 Optimierung des Mutationsscreenings 54
3.1.1 Qualität und Quantität der isolierten DNA 54
3.1.2. PCR-Etablierung 55
3.1.2.1 Primersequenzen 56
3.1.2.2 Magnesiumchlorid-Konzentration 56
3.1.2.3 Annealingtemperatur 56
Inhaltsverzeichnis
3.1.2.4 Reaktionszyklenzahl 58
3.1.2.5 DNA-Konzentration 58
3.1.3 Protokoll zur Amplifizierung der Mikrosatelliten-Marker 60
3.1.4 DHPLC 60
3.1.4.1 Schmelzpunkte 60
3.1.4.1.1 Schmelzpunktbestimmung mittels DHPLC-Melt-Software 61
3.1.4.1.2 Schmelzpunktbestimmung mittels Wavemaker-Software 62
3.1.4.1.3 Praktische Schmelzpunktbestimmung mittels DHPLC 64
3.1.4.2 Fließmittelgradienten 65
3.1.5 Sequenzierung 66
3.1.5.1 Charakteristika und Detektionsmöglichkeiten der verschiedenen 66
Basenveränderungen
3.2 Charakteristika der Patientengruppe 67
3.2.1 Patienten mit Proteus Syndrom 67
3.2.2 Patientinnen mit familiärem hereditären Mammakarzinom 67
3.2.3 Patienten mit Glioblastom 67
3.3 Molekulargenetische Analysen des PTEN-Gens 68
3.3.1 LOH-Analyse im Tumorgewebe von Proteus Syndrom 68
3.3.2 DHPLC-Analyse 71
3.3.2.1 Proteus Syndrom-Patienten 71
3.3.2.2 Brustkrebs-Patienten 72
3.3.2.3 Glioblastom-Patienten 73
3.3.3 Sequenz-Analyse 74
3.3.3.1 Polymorphismen 75
3.3.3.2 Mutationen 77
3.3.4 Kontrolluntersuchungen für Polymorphismen 78
3.3.5 Statistische Analyse 79
4. Diskussion 80
4.1 PTEN-Gentest 80
Inhaltsverzeichnis
4.2 Methodenoptimierung 81
4.2.1 PCR 81
4.2.2 MSI- und LOH-Analyse 84
4.2.3 DHPLC 85
4.2.4 Sequenzierung 89
4.3 Molekulargenetik des PTEN-Gens 91
4.3.1 Verlust von Heterozygotie 92
4.3.2 Polymorphismen 93
4.3.3 Mutationen 96
4.3.3.1 Proteus Syndrom 96
4.3.3.2 Mamma- und Ovarialkarzinom 97
4.3.3.3 Glioblastom 101
5. Zusammenfassung 103
6. Literaturverzeichnis 105
7. Anhang
1. Zusammenstellung der klinischen Daten der Patienten mit Proteus
Syndrom
2. Die Patientinnen mit familiärem hereditärem Mamma- oder
Ovarialkarzinom, deren Familiengeschichten und deren
Keimbahnpolymorphismen
3. Patienten mit Glioblastom, deren Polymorphismen und Mutationen
Verzeichnis der Abbildungen V
Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1.1 Exon / Intron Struktur des PTEN-Gens 8
Abb. 1.2 Proteindomänen des PTEN-Gens 8
Abb. 1.3 PTEN als ein Regler bei der PBK-Reaktion 10
Abb. 1.4 PTEN als ein Modulator in der MAPK Reaktion 10
Abb. 1.5 Der Standort der PTEN Keimbahnmutationen 11
Abb. 2.1 Schematische Darstellung der Homo- und Heteroduplex-Bildung durch 41
Hybridisierung
Abb. 2.2 Beispiel der temperaturabhängigen Auftrennung der DNA-Duplex- 42
Moleküle
Abb. 2.3 Idealfall der Heteroduplex- und Homoduplex-Auftrennung in 4 Peaks 46
Abb. 2.4 Mutationspeak, der lediglich durch eine zusätzliche Schulter vor dem 46
Wildtyp erkennbar ist
Abb. 2.5 Chromatogramm mit drei Peaks: zwei Heteroduplex-Peaks; ein 46
Homoduplex-Peak
Abb. 2.6 Mutationsstandard 47
Abb. 2.7 Struktur der denaturierenden Substanzen: Harnstoff und Formamid 51
Abb. 3.1 Elektrophoretische Auftrennung aller Exons 1-9 des PTEN-Gens mit 59
verschieden MgC^-Konzentrationen und Annealingtemperaturen in einem
2% Agarosegel
Abb. 3.2 Elektrophoretische Auftrennung aller Exons 1-9 des PTEN-Gens mit 60
endgültig ausgewählten Annealingtemperaturen und MgC^-
Konzentrationen in einem 2% Agarosegel
Abb. 3.3 Schmelzkurve des Exons 6 des PTEN-Gens laut Wavemaker-Software 62
Abb. 3.4 Schmelzverhalten des Exons 6 des PTEN-Gens bei 53.9°C, 54.9°C und 63
55.9°C
Abb. 3.5 Domänenschmelzkurve des Exons 6 des PTEN-Gens 63
Abb. 3.6 Schmelzpunktbestimmung des Exons 5 mit verschiedenen Temperaturen 64
53°C-56°C
Verzeichnis der Abbildungen VI
Abb. 3.7 Schmelzpunktbestimmung des Exons 8 mit verschiedenen Temperaturen 65
53°C-56°C
Abb. 3.8 LOH-Analyse mit 9 Mikrosatelliten. Vergleich von Blut- und 69
Tumorproben von Patientin 1. 518/00-1 bezeichnet jeweils die Blutprobe,
518/00-3 jeweils die Tumorprobe.
Abb. 3.9 LOH-Analyse mit 9 Mikrosatelliten. Vergleich von Blut- und 70
Tumorproben von Patientin 2. 211/01 bezeichnet jeweils die Blutprobe,
212/01 jeweils die Tumorprobe.
Abb. 3.10 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exons 8: Vergleich von 71
Kontroll- und Patienten-Proben
Abb. 3.11 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exons 9: Vergleich von 71
Kontroll- und Patienten-Proben
Abb. 3.12 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exons 2: Vergleich von 72
Kontroll- und Patienten-Proben
Abb. 3.13 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exons 4: Vergleich von 72
Kontroll- und Patienten-Proben
Abb. 3.14 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exon 3 aus Glioblastom: 74
Vergleich bei verschiedenen Temperaturen, 52°C, 55°C und 56°C
Abb. 3.15 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exon 6 aus Glioblastom: 74
Vergleich bei verschiedenen Temperaturen, 54°C, 55°C und 56°C
Abb. 3.16 Vorwärts- und Rückwärtssequenzen des Exons 8 mit PolyT im Intron IVS 75
7
Abb. 3.17 Vorwärts- und Rückwärtssequenzen des Exons 9 mit PolyT in der 3 -UTR 76
Abb. 3.18 Vorwärts- und Rückwärtssequenzen mit einer heterozygoten 76
Basensubstitution
Abb. 3.19 Vorwärts- und Rückwärtssequenzen mit Insertion von 5 Basen 77
Abb. 3.20 Ergebnisbeispiel der Mutationsanalyse des Exons 2 mittels Sequence 78
Navigator
Abb. 3.21 Ergebnisbeispiel der Mutationsanalyse des Exons 4 mittels Sequence 78
Navigator
Verzeichnis der Tabellen VII
Verzeichnis der Tabellen
Tab. 1.1 Klinische Diagnosekriterien des Proteus Syndroms 2
Tab. 1.2 Ungefähre Frequenzen des LOH auf 10q23-q24 und somatischer 12
PTEN-Mutationen in den Primär- und Sekundärtumoren (Metastasen)
Tab. 1.3 Somatische Mutationen im Mamma- und Ovarialkarzinom 14
Tab. 1.4 Verfahren für die Suche nach Punktmutationen in einem Gen 17
Tab. 2.1 Technische Geräte 22
Tab. 2.2 Reagenzien 22
Tab. 2.3 Lösungen und Puffer 23
Tab. 2.4 Enzyme 23
Tab. 2.5 Standards und Farbstoffe 24
Tab. 2.6 Kits 24
Tab. 2.7 Mikrosatelliten-Marker und deren Primersequenzen zur LOH-Analyse 25
Tab. 2.8 Zusammensetzung der Agarose-und Metaphorgele 29
Tab. 2.9 Menge der PCR-Komponenten 32
Tab. 2.10 Thermocycler-Programm 33
Tab. 2.11 Die Mikrosatellitenmarker und denen Lokalisation 35
Tab. 2.12 Reaktionsansatz mit dem Kit sowie ohne Kit 36
Tab. 2.13 Thermocycler-Programm 36
Tab. 2.14 Ansatz zur Fragmentanalyse 37
Tab. 2.15 Zusammensetzung aller Page-Plus-Gele 38
Tab. 2.16 Technische Parameter/Einstellung am ABI PRISM™ 377 39
Tab. 2.17 Beispiel einer Verwendung der Fließmittelgradienten mit den 44
Konzentrations- und Zeitangaben sowie die nähere Bezeichnung der
enthaltenen vier Schritte
Tab. 2.18 Mengen der Komponenten eines Sequenzierungsansatzes 49
Tab. 2.19 Standard-Sequenzierungs-Programm 49
Tab. 2.20 Vorbereitung des Premixes 50
Tab. 3.1 Die Primersequenzen 55
Verzeichnis der Tabellen VIII
Tab. 3.2 Theoretische Annealingtemperaturen der Primer für jedes 57
PCR-Fragment
Tab. 3.3 Experimentale Annealingtemperaturen 57
Tab. 3.4 Endgültige Annealingtemperaturen und MgC^-Konzentrationen aller 9 59
Fragmente zur Amplifizierung des kodierten Bereichs des PTEN-Gens
Tab. 3.5 Resultate der DHPLC-Melt-Software und Wavemaker-Software für 9 62
Exons des PTEN-Gens und die Positionen jedes Exons in den
Fragmenten
Tab. 3.6 Resultate der DHPLC-Etablierung mit Temperaturen und Puffer 66
B-Konzentrationsgradienten
Tab. 3.7 Ergebnisse der PTEN-Analyse mittels DHPLC bei Proteus Syndrom, 73
Mamma- und Ovarialkarzinom und Glioblastom
Tab. 3.8 Häufigkeiten der zwei Polymorphismen in Kontrollproben 79
Tab. 3.9 Statistische Daten der Polymorphismen im Mammakarzinom 79
Tab. 4.1 Keimbahn-Polymorphismen des PTEN-Gens im familiären 94
Mammakarzinom
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsliste I
Verzeichnis der Abbildungen V
Verzeichnis der Tabellen VII
1. Einleitung 1
1.1 Proteus Syndrom 1
1.2 Familiärer hereditärer Brustkrebs 3
1.2.1 Krebsentstehung 3
1.2.2 Brustkrebs 4
1.3 Glioblastom 6
1.4 PTEN-Gen 7
1.4.1 Darstellung 7
1.4.2 PTEN-Protein 8
1.4.3 Überblick über die Keimbahn- und somatischen Mutationen in PTEN 11
1.4.3.1 PTEN-Mutationen bei Proteus Syndrom 13
1.4.3.2 PTEN-Mutationen in familiärem hereditären Brustkrebs 13
1.4.3.3 PTEN-Mutationen im Glioblastom 15
1.5 Techniken zur Detektion von Sequenzvarianten des PTEN-Gens 15
1.5.1 Verlust von Heterozygotie 15
1.5.2 Mutationsnachweis 16
1.5.2.1 DHPLC 18
1.5.2.2 Direktsequenzierung 18
1.5.2.3 Computer-unterstützte Mutationsanalyse 19
1.6 Zielstellung 19
2 Material und Methoden 21
2.1 Untersuchungsmaterial 21
2.1.1 Patienten und Kontrollpersonen 21
Inhaltsverzeichnis
2.1.2 Technische Geräte 22
2.1.3 Chemikalien 22
2.1.3.1 Reagenzien 22
2.1.3.2 Stammlösungen und Puffer 23
2.1.3.3 Enzyme 23
2 13 4 Standards und Farbstoffe 24
2.1.3.5 Kits 24
2.1.3.6 Primer 24
2.1.4 Softwareprogramme, Datenbanken und Sequenzquellen 26
2.1.4.1 Software zum Primerdesign 26
2.1.4.2 Software zur Schmelzpunktbestimmung 26
2.1.4.3 ABI PRISM™ Software zur Sequenz-und Fragmentanalyse 26
2.1.4.4 Software zur statistischen Datenanalyse 26
2.1.4.5 Sequenz-und Mutationsdatenbanken (Online) 27
2.2 Methoden 27
2.2.1 DNA-Isolierung aus Vollblut und Tumorgewebe 27
2.2.2 Agarose-Gelelektrophorese 29
2.2.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) 30
2.2.3.1 Primerdesign 31
2.2.3.1.1 Mg2+-Konzentration im Reaktionsansatz 32
2.2.3.1.2 Annealingtemperatur 33
2.2.3.1.3 Elektrophorese der PCR-Produkte 33
2.2.4 Fragmentanalyse für den Nachweis von LOH und Mikrosatelliten- 33
instabilität
2.2.4.1 Mikrosatellitenmarker 34
2.2.4.2 PCR-Ansatz und -Programm 35
2.2.4.3 Vorbereitung zur Fragmentanalyse 36
2.2.4.4 Elektrophorese und Detektion der Fragmentanalyseprodukte im ABI 37
PRISM™ 377
2.2.4.4.1 Vorbereitung der Glasgeräte 37
Inhaltsverzeichnis
2.2.4.4.2 Gelherstellung 38
2.2.4.4.3 Elektrophorese der Fragmente 39
2.2.4.4.4 Fragmentanalyse 39
2.2.5 DHPLC-Analyse 40
2.2.5.1 Prinzip des Verfahrens 40
2.2.5.1.1 Säulenmaterial und Fließmittel 40
2.2.5.1.2 Temperaturmodulierende Heteroduplexanalyse (TMHA) 41
2.2.5.2 Vorbereitung des Systems zur Analyse 42
2.2.5.3 Probenvorbereitung 43
2.2.5.4 Puffer-Herstellung 43
2.2.5.5 Erstellung der Standardfließmittelgradienten 43
2.2.5.6 Theoretische und praktische Schmelzpunktbestimmung 44
2.2.5.7 Mutationsdetektion 45
2.2.6 Sequenzierung 47
2.2.6.1 Reinigung der PCR-Produkte 48
2.2.6.2 Sequenzierungsansatz und Programm 49
2.2.6.3 Fällung der Sequenzierungsprodukte 49
2.2.6.4 Gelherstellung 50
2.2.6.5 Elektrophorese der Sequenzierungsprodukte 51
2.2.6.6 Sequenzanalyse 52
2.2.7 Kotrolluntersuchungen 52
2.2.8 Statistische Datenanalyse 53
3. Ergebnisse 54
3.1 Optimierung des Mutationsscreenings 54
3.1.1 Qualität und Quantität der isolierten DNA 54
3.1.2. PCR-Etablierung 55
3.1.2.1 Primersequenzen 56
3.1.2.2 Magnesiumchlorid-Konzentration 56
3.1.2.3 Annealingtemperatur 56
Inhaltsverzeichnis
3.1.2.4 Reaktionszyklenzahl 58
3.1.2.5 DNA-Konzentration 58
3.1.3 Protokoll zur Amplifizierung der Mikrosatelliten-Marker 60
3.1.4 DHPLC 60
3.1.4.1 Schmelzpunkte 60
3.1.4.1.1 Schmelzpunktbestimmung mittels DHPLC-Melt-Software 61
3.1.4.1.2 Schmelzpunktbestimmung mittels Wavemaker-Software 62
3.1.4.1.3 Praktische Schmelzpunktbestimmung mittels DHPLC 64
3.1.4.2 Fließmittelgradienten 65
3.1.5 Sequenzierung 66
3.1.5.1 Charakteristika und Detektionsmöglichkeiten der verschiedenen 66
Basenveränderungen
3.2 Charakteristika der Patientengruppe 67
3.2.1 Patienten mit Proteus Syndrom 67
3.2.2 Patientinnen mit familiärem hereditären Mammakarzinom 67
3.2.3 Patienten mit Glioblastom 67
3.3 Molekulargenetische Analysen des PTEN-Gens 68
3.3.1 LOH-Analyse im Tumorgewebe von Proteus Syndrom 68
3.3.2 DHPLC-Analyse 71
3.3.2.1 Proteus Syndrom-Patienten 71
3.3.2.2 Brustkrebs-Patienten 72
3.3.2.3 Glioblastom-Patienten 73
3.3.3 Sequenz-Analyse 74
3.3.3.1 Polymorphismen 75
3.3.3.2 Mutationen 77
3.3.4 Kontrolluntersuchungen für Polymorphismen 78
3.3.5 Statistische Analyse 79
4. Diskussion 80
4.1 PTEN-Gentest 80
Inhaltsverzeichnis
4.2 Methodenoptimierung 81
4.2.1 PCR 81
4.2.2 MSI- und LOH-Analyse 84
4.2.3 DHPLC 85
4.2.4 Sequenzierung 89
4.3 Molekulargenetik des PTEN-Gens 91
4.3.1 Verlust von Heterozygotie 92
4.3.2 Polymorphismen 93
4.3.3 Mutationen 96
4.3.3.1 Proteus Syndrom 96
4.3.3.2 Mamma- und Ovarialkarzinom 97
4.3.3.3 Glioblastom 101
5. Zusammenfassung 103
6. Literaturverzeichnis 105
7. Anhang
1. Zusammenstellung der klinischen Daten der Patienten mit Proteus
Syndrom
2. Die Patientinnen mit familiärem hereditärem Mamma- oder
Ovarialkarzinom, deren Familiengeschichten und deren
Keimbahnpolymorphismen
3. Patienten mit Glioblastom, deren Polymorphismen und Mutationen
Verzeichnis der Abbildungen V
Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1.1 Exon / Intron Struktur des PTEN-Gens 8
Abb. 1.2 Proteindomänen des PTEN-Gens 8
Abb. 1.3 PTEN als ein Regler bei der PBK-Reaktion 10
Abb. 1.4 PTEN als ein Modulator in der MAPK Reaktion 10
Abb. 1.5 Der Standort der PTEN Keimbahnmutationen 11
Abb. 2.1 Schematische Darstellung der Homo- und Heteroduplex-Bildung durch 41
Hybridisierung
Abb. 2.2 Beispiel der temperaturabhängigen Auftrennung der DNA-Duplex- 42
Moleküle
Abb. 2.3 Idealfall der Heteroduplex- und Homoduplex-Auftrennung in 4 Peaks 46
Abb. 2.4 Mutationspeak, der lediglich durch eine zusätzliche Schulter vor dem 46
Wildtyp erkennbar ist
Abb. 2.5 Chromatogramm mit drei Peaks: zwei Heteroduplex-Peaks; ein 46
Homoduplex-Peak
Abb. 2.6 Mutationsstandard 47
Abb. 2.7 Struktur der denaturierenden Substanzen: Harnstoff und Formamid 51
Abb. 3.1 Elektrophoretische Auftrennung aller Exons 1-9 des PTEN-Gens mit 59
verschieden MgC^-Konzentrationen und Annealingtemperaturen in einem
2% Agarosegel
Abb. 3.2 Elektrophoretische Auftrennung aller Exons 1-9 des PTEN-Gens mit 60
endgültig ausgewählten Annealingtemperaturen und MgC^-
Konzentrationen in einem 2% Agarosegel
Abb. 3.3 Schmelzkurve des Exons 6 des PTEN-Gens laut Wavemaker-Software 62
Abb. 3.4 Schmelzverhalten des Exons 6 des PTEN-Gens bei 53.9°C, 54.9°C und 63
55.9°C
Abb. 3.5 Domänenschmelzkurve des Exons 6 des PTEN-Gens 63
Abb. 3.6 Schmelzpunktbestimmung des Exons 5 mit verschiedenen Temperaturen 64
53°C-56°C
Verzeichnis der Abbildungen VI
Abb. 3.7 Schmelzpunktbestimmung des Exons 8 mit verschiedenen Temperaturen 65
53°C-56°C
Abb. 3.8 LOH-Analyse mit 9 Mikrosatelliten. Vergleich von Blut- und 69
Tumorproben von Patientin 1. 518/00-1 bezeichnet jeweils die Blutprobe,
518/00-3 jeweils die Tumorprobe.
Abb. 3.9 LOH-Analyse mit 9 Mikrosatelliten. Vergleich von Blut- und 70
Tumorproben von Patientin 2. 211/01 bezeichnet jeweils die Blutprobe,
212/01 jeweils die Tumorprobe.
Abb. 3.10 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exons 8: Vergleich von 71
Kontroll- und Patienten-Proben
Abb. 3.11 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exons 9: Vergleich von 71
Kontroll- und Patienten-Proben
Abb. 3.12 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exons 2: Vergleich von 72
Kontroll- und Patienten-Proben
Abb. 3.13 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exons 4: Vergleich von 72
Kontroll- und Patienten-Proben
Abb. 3.14 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exon 3 aus Glioblastom: 74
Vergleich bei verschiedenen Temperaturen, 52°C, 55°C und 56°C
Abb. 3.15 Chromatogramm der DHPLC-Analyse des Exon 6 aus Glioblastom: 74
Vergleich bei verschiedenen Temperaturen, 54°C, 55°C und 56°C
Abb. 3.16 Vorwärts- und Rückwärtssequenzen des Exons 8 mit PolyT im Intron IVS 75
7
Abb. 3.17 Vorwärts- und Rückwärtssequenzen des Exons 9 mit PolyT in der 3'-UTR 76
Abb. 3.18 Vorwärts- und Rückwärtssequenzen mit einer heterozygoten 76
Basensubstitution
Abb. 3.19 Vorwärts- und Rückwärtssequenzen mit Insertion von 5 Basen 77
Abb. 3.20 Ergebnisbeispiel der Mutationsanalyse des Exons 2 mittels Sequence 78
Navigator
Abb. 3.21 Ergebnisbeispiel der Mutationsanalyse des Exons 4 mittels Sequence 78
Navigator
Verzeichnis der Tabellen VII
Verzeichnis der Tabellen
Tab. 1.1 Klinische Diagnosekriterien des Proteus Syndroms 2
Tab. 1.2 Ungefähre Frequenzen des LOH auf 10q23-q24 und somatischer 12
PTEN-Mutationen in den Primär- und Sekundärtumoren (Metastasen)
Tab. 1.3 Somatische Mutationen im Mamma- und Ovarialkarzinom 14
Tab. 1.4 Verfahren für die Suche nach Punktmutationen in einem Gen 17
Tab. 2.1 Technische Geräte 22
Tab. 2.2 Reagenzien 22
Tab. 2.3 Lösungen und Puffer 23
Tab. 2.4 Enzyme 23
Tab. 2.5 Standards und Farbstoffe 24
Tab. 2.6 Kits 24
Tab. 2.7 Mikrosatelliten-Marker und deren Primersequenzen zur LOH-Analyse 25
Tab. 2.8 Zusammensetzung der Agarose-und Metaphorgele 29
Tab. 2.9 Menge der PCR-Komponenten 32
Tab. 2.10 Thermocycler-Programm 33
Tab. 2.11 Die Mikrosatellitenmarker und denen Lokalisation 35
Tab. 2.12 Reaktionsansatz mit dem Kit sowie ohne Kit 36
Tab. 2.13 Thermocycler-Programm 36
Tab. 2.14 Ansatz zur Fragmentanalyse 37
Tab. 2.15 Zusammensetzung aller Page-Plus-Gele 38
Tab. 2.16 Technische Parameter/Einstellung am ABI PRISM™ 377 39
Tab. 2.17 Beispiel einer Verwendung der Fließmittelgradienten mit den 44
Konzentrations- und Zeitangaben sowie die nähere Bezeichnung der
enthaltenen vier Schritte
Tab. 2.18 Mengen der Komponenten eines Sequenzierungsansatzes 49
Tab. 2.19 Standard-Sequenzierungs-Programm 49
Tab. 2.20 Vorbereitung des Premixes 50
Tab. 3.1 Die Primersequenzen 55
Verzeichnis der Tabellen VIII
Tab. 3.2 Theoretische Annealingtemperaturen der Primer für jedes 57
PCR-Fragment
Tab. 3.3 Experimentale Annealingtemperaturen 57
Tab. 3.4 Endgültige Annealingtemperaturen und MgC^-Konzentrationen aller 9 59
Fragmente zur Amplifizierung des kodierten Bereichs des PTEN-Gens
Tab. 3.5 Resultate der DHPLC-Melt-Software und Wavemaker-Software für 9 62
Exons des PTEN-Gens und die Positionen jedes Exons in den
Fragmenten
Tab. 3.6 Resultate der DHPLC-Etablierung mit Temperaturen und Puffer 66
B-Konzentrationsgradienten
Tab. 3.7 Ergebnisse der PTEN-Analyse mittels DHPLC bei Proteus Syndrom, 73
Mamma- und Ovarialkarzinom und Glioblastom
Tab. 3.8 Häufigkeiten der zwei Polymorphismen in Kontrollproben 79
Tab. 3.9 Statistische Daten der Polymorphismen im Mammakarzinom 79
Tab. 4.1 Keimbahn-Polymorphismen des PTEN-Gens im familiären 94
Mammakarzinom |
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