Nicht-invasive pränatale Diagnostik an fetalen kernhaltigen Erythrozyten aus mütterlichem Blut:
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2003
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INHALTSVERZEICHNIS
L
I. INHALTSVERZEICHNIS
I LUUAIUVCI 4C1VI1IK19 YYYYYYYYYY
N. ABBILDUNGSVERZEICHNIS.
HI.
ABKOERZUNGSVERZEICHNIS.
4
1 EINLEITUNG.
1.1 INVASIVE PRAENATALDIAGNOSTIK.7
1.1.1 PRAENATALDIAGNOSTIK - KONVENTIONELLE ROUTINEUNTERSUCHUNG.7
1.2 NICHT-INVASIVE PRAENATALDIAGNOSTIK.7
1.2.1 ETABLIERTE METHODEN DER NICHT-INVASIVEN PRAENATALDIAGNOSTIK.8
1.2.2 FETALE ZELLEN IM MUETTERLICHEN BLUT - IHRE BEDEUTUNG FUER EINE
NICHT-INVASIVE PRAENATALE DIAGNOSTIK.8
1.2.2.1 ISOLIERUNG VON FETALEN ZELLEN.9
1.2.2.2 KULTIVIERUNG VON FETALEN ZELLEN AUS MUETTERLICHEM BLUT.11
1.2.2.3 ISOLIERUNG VON FETALER DNA AUS BLUTPLASMA UND SERUM.11
1.2.3 DIE ZUKUENFTIGE BEDEUTUNG DER NICHT-INVASIVEN PRAENATALDIAGNOSTIK IN
DER GESELLSCHAFT.11
2 ZIEL DER
ARBEIT.^.
13
2.1 SPEZIFISCHE ANREICHERUNG DER FETALEN ZELLEN UEBER
ANTIKOERPERMARKIERUNG.13
2.2 OPTIMIERUNG DER KULTURBEDINGUNGEN VON FETALEN ZELLEN.14
2.3 IMINORTALISIERUNG.14
3 MATERIAL UND
METHODEN.
16
3.1 MATERIAL.16
3.1.1 TECHNISCHE AUSRUESTUNG.16
3.1.2 CHEMIKALIEN.16
3.1.3 PUFFER UND LOESUNGEN.17
3.1.4 KITS UND REAGENZIENSAETZE.18
3.1.5 OLIGONUKLEOTIDE.18
3.1.5.1 PCR-PRIMER.18
3.1.6 FISH-SONDEN.19
3.1.7 KULTURMEDIEN.19
3.1.8 LB-MEDIUM.19
3.1.9 EINFRIEREN VON BAKTERIENKULTUREN.19
3.2 METHODEN.20
3.2.1 SCHWANGERENBLUT.21
3.2.2 DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION.21
3.2.2.1 PROTOKOLL ZUR EINFECHDICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFIIGATION.21
3.2.2 2 PROTOKOLL ZUR DREIFACHDICHTEGRADIENTCN-ZENTRIFUGATION.21
3.2.3 MAGNETISCHE ZELLSORTIERUNG (MAGNETIC ACTIVATED CELL SORTING,
MACS). *.23
3.2.4 ONCOQUICK.23
3.2.4.1 PROTOKOLL.24
3.2.5 SAMMELN VON EINZELZELLEN.25
3.2.6 DNA-ISOLATION AUS BLUT UND FRUCHTWASSER.25
3.2.6.1 PROTOKOLL (NACH QIAGEN).25
3.2.7 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DURCH UV-SPEKTROMETRIE.26
3.2.8 PROTEINASE K-VERDAU VON EINZELZELLEN ZUM AUFSCHLIESSEN DER DNA.26
3.2.9 POLYMERASE KETTENREAKTION.27
3.2.9.1 KOMPONENTEN DER EINZELZELL-PCR.29
3.2.9.2 PCR-PROTOKOLL.29
3.2.10 QUANTITATIVE REALTIME PCR.29
3.2.10.1 ZUSAMMENSETZUNG DER QPCR FIIR SYBR GREEN 1.30
3.2.10.2 PROTOKOLL.31
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/967804213
INHALTSVERZEICHNIS
2
3.2.11 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNNG VON DNA - FRAGMENTEN. 31
3.2.11.1 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (PAGE).31
3.2.11.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.32
3.2.12 FLUORESZENZ IN-SITU HYBRIDISIERUNG (FISH).33
3.2.13 PRAEPARATION VON BLUTZELLEN FUER DIE FISH-ANALYSE.34
3.2.13.1 PROTOKOLL ZUR GEWINNUNG DER ZELLEN.34
3.2.13.2 ALTERNATIVE FIXIERUNG DER ZELLEN.36
3.2.13.3 PRAEPARATION DER KULTIVIERTEN ZELLEN FUER FISH.36
3.2.14 KULTIVIERUNG VON NUKLEIERTEN VORLAEUFERZELLEN DER ROTEN REIHE.37
3.2.15 NACHWEIS VON DNA DURCH RESTRIKTIONSFRAGMENTANALYSE.37
3.2.15.1 SPALTUNG MIT HILFE DES RESTRIKTIONSENZYMS ECO RI.37
3.2.16 KLONIERUNG.39
3.2.16.1 ISOLIERUNG VON DNA (GENOMISCH ODER CDNA) UND PLASMID-DNA.40
3.2.16.2 RESTRIKTIONSSPALTUNG DER DNA UND DES PLASMIDS. 40
3.2.16.3 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN MIT DER PLASMID-DNA.40
3.2.16.4 TRANSFORMATION VON PLASMIDEN IN HUMANE ZELLEN.41
3.2.16.5 PLASMIDISOLIERUNG AUS EINEM BAKTERIENKLON.43
3.2.17 MIKROSKOPISCHE AUSWERTUNG DER ZELLEN.43
3.2.17.1 LICHTMIKROSKOPIE.43
3.2.17.2 FLUORESZENZMIKROSKOPIE.44
4 ERGEBNISSE._
45
4.1 ISOLIERUNG VON EINZELZELLEN MIT CD71 UND IHRE CHARAKTERISIERUNG UEBER
EINZELZELL-PCR.45
4.2 CD71-MACS SELEKTIERTE ZELLEN UND IHRE EVALUIERUNG MIT EINEM
FLUORESZENZMARKIERTEN
ANTIKOERPER.47
4.3 VERSCHIEDENE ANTIKOERPER FUER DIE SPEZIFISCHE MARKIERUNG VON FETALEN
ZELLEN.49
4.3.1 CHARAKTERISIERUNG DER ANTIKOERPER.49
4.3.1.1 2G5 UND 3F9. 49
4.3.1.2 FLKL.49
4.3.1.3 EPO-R.49
4.3.2 VERGLEICH DER EFFEKTIVITAET DER UNTERSUCHTEN ANTIKOERPER MIT DEM
CD71-ANTIKOERPER.50
4.4 VERSCHIEDENE KULTURMEDIEN FUER EINE SPEZIFISCHE ANZUCHT VON FETALEN
ZELLEN.54
4.4.1 MODIFIKATION DES BASISKULTURMEDIUMS CHANG C.54
4.4.2 AUSTESTUNG VON WEITEREN KULTURMEDIEN.55
4.4.2.1 STEM.ODLE.55
4.4.2.2 C-PLUS MEDIUM SELECT.56
4.4.2.3 STEMSPAN SF EXPANSIONS MEDIUM.56
4 4.2.4 VORVERSUCHE MIT DEM KOMPLETTMEDIUM METHOCULT 4431. 57
4 4.2.5 ERGEBNISSE DER KULTIVIERUNGSVERSUCHE MIT METHOCULT 4431 IN EINER
AUSGEDEHNTEN STUDIE.59
4.5 IMMORTALISIERUNG.65
4.6 ANALYSE DER ZELLEN AUS MATEMALEM BLUT NACH
ONCOQUICK-AUFREINIGUNG.68
5
DISKUSSION.
69
5.1 MICROBEADMARKIERUNG FUER DAS COMPUTERUNTERSTUETZTE SCANNEN VON FETALEN
ZELLEN.69
5.2 SPEZIFISCHE ANTIKOERPER FUER DIE MARKIERUNG VON NUKLEIERTEN
ERYTHROZYTEN.70
5.3 KULTIVIERUNG VON FETALEN ZELLEN AUS MATEMALEM BLUT.72
5.4 IMMORTALISIERUNG.75
6
ZUSAMMENFASSUNG.
76
7
LITERATURVERZEICHNIS.
79
8
DANKSAGUNG.
87 |
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