Lokalisation und Charakterisierung von Mutationen im Faktor-VIII-Gen bei hämophilen Patienten mittels Denaturierender-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (DHPLC):
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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2005
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| Beschreibung: | 89 S. Ill., graph. Darst. |
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Inhalt
Seite
1. Einleitung 6
1.1 Funktion des Faktor VIII im Blutgerinnungssystem 8
1.2 Faktor Vlll-Gen 9
1.3 Mutationen im Faktor Vlll-Gen 10
1.4 Proteinstruktur des Faktor VIII 13
1.5 Klinik der Hämophilie A 15
1.6 Zielsetzung 18
2. Material und Methoden 19
2.1 Chemikalien, Enzyme, Verbrauchsmaterial 19
2.2 Geräte 19
2.3 Puffer und Lösungen 20
2.4 Faktor Vlll-Oligonukleotide 21
2.5 Methoden 22
2.5.1 Konzentrationsbestimmung der DNA 22
2.5.2 DNA-Amplifikation durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 22
2.5.3 Agarose - Gel-Elektrophorese 24
2.5.4 Heteroduplexbildung 24
2.5.5 Denaturierende-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (DHPLC) 26
2.5.6 Sequenzierung 31
4
3. Ergebnisse 34
3.1 Lokalisation und Charakterisierung von Mutationen im Faktor-Vlll-Gen
bei Patienten mittels DHPLC 34
3.1.1 Detektionsergebnisse durch die DHPLC 35
3.1.2 Mutationshotspots im Faktor Vlll-Gen 37
3.1.3 Phänotypen der Hämophilie A Patienten 41
3.1.4 Aufteilung der Mutationstypen nach Schweregrad und Korrelation der
Mutationstypen mit der Hemmkörperentwicklung 41
3.2 Optimierung der DHPLC 45
3.2.1 Überarbeitung des DHPLC-Protokolls 46
3.2.2 Erneute DHPLC-Analyse von DNA-Proben hämophiler Patienten nach
Mutationsdetektion durch Komplettsequenzierung 49
3.2.3 Reduktion der Sequenzierungsnotwendigkeit bei den häufigen
Polymorphismen in der B-Domäne (AS 1241/1269) 53
4. Diskussion 57
4.1 Retrospektive Auswertung der Mutationsdetektionsrate des
Screenings 57
4.1.1 Vergleich der Mutationsdaten aus den DHPLC-Analysen mit der
internationalen Faktor Vlll-Datenbank „HAMSTeRS 58
4.1.2 Mutations-Hotspots 61
4.1.3 Schweregrad, Hemmkörper und Mutationstypen der Hämophilie A 63
4.2 Optimierung des Faktor VIII-DHPLC-Mutationsscreening 64
4.2.1 Reduktion der bei der DHPLC-Analyse benötigten Schmelztemperaturen 64
4.2.2 Erneute DHPLC-Analyse von DNA-Proben hämophiler Patienten nach
Mutationsdetektion durch Komplettsequenzierung 65
4.2.3 Reduktion der Sequenzierungsfrequenz bei den häufigen Polymorphismen
in der B-Domäne (AS 1241 /1269) 70
5
5. Zusammenfassung 71
6. Literaturverzeichnis 73
7. Anhang Mutationsübersichten 81
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3
Inhalt
Seite
1. Einleitung 6
1.1 Funktion des Faktor VIII im Blutgerinnungssystem 8
1.2 Faktor Vlll-Gen 9
1.3 Mutationen im Faktor Vlll-Gen 10
1.4 Proteinstruktur des Faktor VIII 13
1.5 Klinik der Hämophilie A 15
1.6 Zielsetzung 18
2. Material und Methoden 19
2.1 Chemikalien, Enzyme, Verbrauchsmaterial 19
2.2 Geräte 19
2.3 Puffer und Lösungen 20
2.4 Faktor Vlll-Oligonukleotide 21
2.5 Methoden 22
2.5.1 Konzentrationsbestimmung der DNA 22
2.5.2 DNA-Amplifikation durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 22
2.5.3 Agarose - Gel-Elektrophorese 24
2.5.4 Heteroduplexbildung 24
2.5.5 Denaturierende-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (DHPLC) 26
2.5.6 Sequenzierung 31
4
3. Ergebnisse 34
3.1 Lokalisation und Charakterisierung von Mutationen im Faktor-Vlll-Gen
bei Patienten mittels DHPLC 34
3.1.1 Detektionsergebnisse durch die DHPLC 35
3.1.2 Mutationshotspots im Faktor Vlll-Gen 37
3.1.3 Phänotypen der Hämophilie A Patienten 41
3.1.4 Aufteilung der Mutationstypen nach Schweregrad und Korrelation der
Mutationstypen mit der Hemmkörperentwicklung 41
3.2 Optimierung der DHPLC 45
3.2.1 Überarbeitung des DHPLC-Protokolls 46
3.2.2 Erneute DHPLC-Analyse von DNA-Proben hämophiler Patienten nach
Mutationsdetektion durch Komplettsequenzierung 49
3.2.3 Reduktion der Sequenzierungsnotwendigkeit bei den häufigen
Polymorphismen in der B-Domäne (AS 1241/1269) 53
4. Diskussion 57
4.1 Retrospektive Auswertung der Mutationsdetektionsrate des
Screenings 57
4.1.1 Vergleich der Mutationsdaten aus den DHPLC-Analysen mit der
internationalen Faktor Vlll-Datenbank „HAMSTeRS" 58
4.1.2 Mutations-Hotspots 61
4.1.3 Schweregrad, Hemmkörper und Mutationstypen der Hämophilie A 63
4.2 Optimierung des Faktor VIII-DHPLC-Mutationsscreening 64
4.2.1 Reduktion der bei der DHPLC-Analyse benötigten Schmelztemperaturen 64
4.2.2 Erneute DHPLC-Analyse von DNA-Proben hämophiler Patienten nach
Mutationsdetektion durch Komplettsequenzierung 65
4.2.3 Reduktion der Sequenzierungsfrequenz bei den häufigen Polymorphismen
in der B-Domäne (AS 1241 /1269) 70
5
5. Zusammenfassung 71
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