Die differentielle Genexpression des CD99 in Abhängigkeit von laminaren und turbulenten Strömungsbedingungen:
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2005
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS Seite
1. EINLEITUNG 1
1.1. Atherosklerose 1
1.1.1. Pathogenese der Atherosklerose 1
1.2. Schubspannung 2
1.2.1. Einfluss von Schubspannung auf die Lokalisation von
atherosklerotischen Plaques 3
1.2.2. Einfluss von Schubspannung auf Struktur und Funktion des Endothels 4
1.2.3. Schubspannung und Atherosklerose 5
1.2.4. Regulation der Mechanotransduktion und Genexpression 7
1.3. CD99(MIC2) 7
1.3.1. Allgemeine Funktionen des CD99 8
1.3.2. Schubspannung und CD99 8
1.3.3. Rolle und Bedeutung des CD99-Moleküls in der Pathogenese der
Atherosklerose 9
2. Ziele der Arbeit 9
3. MATERIAL UND METHODEN 10
3.1. Material 10
3.2. Methoden 14
3.2.1. Zellkultur 14
3.2.1.1. Nabelschnurpräparation - HUVEC 14
3.2.2. Applikation von Schubspannung auf Endothelzellen 14
3.2.3. Analyse der mRNA-Expression 15
3.2.3.1. RNA-Isolation aus HUVEC 15
3.2.4. Reverse Transkription 17
3.2.5. Polymerasekettenreaktion 17
3.2.6. Agarosegel-Elektrophorese 18
3.2.7. Aufreinigung von PCR-Produkten 18
3.2.8. Quantitative PCR 19
3.2.8.1. Primerauswahl 19
3.2.8.2. Standardverdünnung 20
3.2.8.3. LightCycler-PCR 21
3.2.9. Proteinexpression des CD99 22
3.2.9.1. Protein-Isolation aus HUVEC 22
3.2.9.2. Proteinbestimmung nach Lowry 23
3.2.9.3. SDS-PAGE 23
3.2.9.4. Western-Blot-Analyse 24
3.2.10. Analyse der Genexpression anhand verschiedener Inhibitoren 25
3.2.11. Datenanalyse 26
4. ERGEBNISSE 27
4.1. Reaktion der Endothelzellkulturen auf differentielle Schubspannung 27
4.2. Regulation der mRNA-Expression des CD99 29
4.3. Regulation der Protein-Expression des CD99 31
4.4. Einfluss der verschiedenen Inhibitoren auf die Genexpression des CD99
unter Schubspannung 33
4.4.1. Einfluss des Cyclosporin A 34
4.4.2. Einfluss von Gadoliniumchlorid 36
4.4.3. Einfluss von SNP 38
4.4.4. Einfluss von Wortmannin 40
5. DISKUSSION 42
5.1. Methodenkritik 42
5.2. Diskussion der Ergebnisse 42
5.2.1. CD99 42
5.2.2. Einfluss verschiedener Strömungsbedingungen auf die Genexpression 44
5.2.3. Zeitabhängigkeit der Regul ation strömungsinduzierter Gene 45
5.2.4. Mechanotransduktion in Endothelzellen 46
5.2.5. Einfluss verschiedener Strömungsbedingungen auf die Proteinexpression 46
5.3. Die Beeinflussung der mRNA-Expression des CD99 durch Inhibitoren 47
5.3.1. Cyclosporin A 47
5.3.2. Gadoliniumchlorid 49
5.3.3. SNP 50
5.3.4. Wortmannin 51
6. ZUSAMMENFASSUNG 53
7. LITERATURVERZEICHNIS 55
ABBILDUNGSVERZEICHNIS Seite
Abbildung 1: schematische Darstellung der hämodynamischen
Schubspannung in einem Blutgefäß 2
Abbildung 2: Lokalisation atherosklerotischer Läsionen 4
Abbildung 3: Antiatherosklerotische Wirkungen laminarer Schubspannung bzw.
Atherosklerotische Wirkung turbulenter Schubspannung 6
Abbildung 4: Modell der Plattenkegel-Schubspannungsapparatur 15
Abbildung 5: konfluente Endothelzellkultur unter stationären Bedingungen 27
Abbildung 6: EC-Kultur nach Applikation einer 24 stündigen
laminaren Schubspannung bei 15 dyn/cm2 28
Abbildung 7: EC-Kultur nach Applikation einer 24 stündigen
turbulenten Schubspannung bei 15 dyn/cm2 28
Abbildung 8: Regulation der mRNA-Expression des CD99vs. 18S-rRNA 29
Abbildung 9a: Quantifizierung der Proteinexpression des CD99 durch
Westemblot-Analyse 31
Abbildung 9b: Regulation der Proteinexpression des CD99 vs. GAPDH 32
Abbildung 10: mRNA-Expression von CD99 vs. 18S-rRNA unter Zugabe
von Cyclosporin A 34
Abbildung 11: mRNA-Expression von CD99 vs. 18S-rRNA unter Zugabe
von Gadolinium 36
Abbildung 12: mRNA-Expression von CD99 vs. 18S-rRNA unter Zugabe
von SNP 38
Abbildung 13: mRNA-Expression von CD99 vs. 18S-rRNA unter Zugabe
von Wortmannin 40
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INHALTSVERZEICHNIS Seite
1. EINLEITUNG 1
1.1. Atherosklerose 1
1.1.1. Pathogenese der Atherosklerose 1
1.2. Schubspannung 2
1.2.1. Einfluss von Schubspannung auf die Lokalisation von
atherosklerotischen Plaques 3
1.2.2. Einfluss von Schubspannung auf Struktur und Funktion des Endothels 4
1.2.3. Schubspannung und Atherosklerose 5
1.2.4. Regulation der Mechanotransduktion und Genexpression 7
1.3. CD99(MIC2) 7
1.3.1. Allgemeine Funktionen des CD99 8
1.3.2. Schubspannung und CD99 8
1.3.3. Rolle und Bedeutung des CD99-Moleküls in der Pathogenese der
Atherosklerose 9
2. Ziele der Arbeit 9
3. MATERIAL UND METHODEN 10
3.1. Material 10
3.2. Methoden 14
3.2.1. Zellkultur 14
3.2.1.1. Nabelschnurpräparation - HUVEC 14
3.2.2. Applikation von Schubspannung auf Endothelzellen 14
3.2.3. Analyse der mRNA-Expression 15
3.2.3.1. RNA-Isolation aus HUVEC 15
3.2.4. Reverse Transkription 17
3.2.5. Polymerasekettenreaktion 17
3.2.6. Agarosegel-Elektrophorese 18
3.2.7. Aufreinigung von PCR-Produkten 18
3.2.8. Quantitative PCR 19
3.2.8.1. Primerauswahl 19
3.2.8.2. Standardverdünnung 20
3.2.8.3. LightCycler-PCR 21
3.2.9. Proteinexpression des CD99 22
3.2.9.1. Protein-Isolation aus HUVEC 22
3.2.9.2. Proteinbestimmung nach Lowry 23
3.2.9.3. SDS-PAGE 23
3.2.9.4. Western-Blot-Analyse 24
3.2.10. Analyse der Genexpression anhand verschiedener Inhibitoren 25
3.2.11. Datenanalyse 26
4. ERGEBNISSE 27
4.1. Reaktion der Endothelzellkulturen auf differentielle Schubspannung 27
4.2. Regulation der mRNA-Expression des CD99 29
4.3. Regulation der Protein-Expression des CD99 31
4.4. Einfluss der verschiedenen Inhibitoren auf die Genexpression des CD99
unter Schubspannung 33
4.4.1. Einfluss des Cyclosporin A 34
4.4.2. Einfluss von Gadoliniumchlorid 36
4.4.3. Einfluss von SNP 38
4.4.4. Einfluss von Wortmannin 40
5. DISKUSSION 42
5.1. Methodenkritik 42
5.2. Diskussion der Ergebnisse 42
5.2.1. CD99 42
5.2.2. Einfluss verschiedener Strömungsbedingungen auf die Genexpression 44
5.2.3. Zeitabhängigkeit der Regul ation strömungsinduzierter Gene 45
5.2.4. Mechanotransduktion in Endothelzellen 46
5.2.5. Einfluss verschiedener Strömungsbedingungen auf die Proteinexpression 46
5.3. Die Beeinflussung der mRNA-Expression des CD99 durch Inhibitoren 47
5.3.1. Cyclosporin A 47
5.3.2. Gadoliniumchlorid 49
5.3.3. SNP 50
5.3.4. Wortmannin 51
6. ZUSAMMENFASSUNG 53
7. LITERATURVERZEICHNIS 55
ABBILDUNGSVERZEICHNIS Seite
Abbildung 1: schematische Darstellung der hämodynamischen
Schubspannung in einem Blutgefäß 2
Abbildung 2: Lokalisation atherosklerotischer Läsionen 4
Abbildung 3: Antiatherosklerotische Wirkungen laminarer Schubspannung bzw.
Atherosklerotische Wirkung turbulenter Schubspannung 6
Abbildung 4: Modell der Plattenkegel-Schubspannungsapparatur 15
Abbildung 5: konfluente Endothelzellkultur unter stationären Bedingungen 27
Abbildung 6: EC-Kultur nach Applikation einer 24 stündigen
laminaren Schubspannung bei 15 dyn/cm2 28
Abbildung 7: EC-Kultur nach Applikation einer 24 stündigen
turbulenten Schubspannung bei 15 dyn/cm2 28
Abbildung 8: Regulation der mRNA-Expression des CD99vs. 18S-rRNA 29
Abbildung 9a: Quantifizierung der Proteinexpression des CD99 durch
Westemblot-Analyse 31
Abbildung 9b: Regulation der Proteinexpression des CD99 vs. GAPDH 32
Abbildung 10: mRNA-Expression von CD99 vs. 18S-rRNA unter Zugabe
von Cyclosporin A 34
Abbildung 11: mRNA-Expression von CD99 vs. 18S-rRNA unter Zugabe
von Gadolinium 36
Abbildung 12: mRNA-Expression von CD99 vs. 18S-rRNA unter Zugabe
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